基于网络毒理学探讨苍耳子的毒性机制※

陈 珂 樊黎丽 侯超峰 杜一杰 孟义人 孟 泳▲

苍耳子（xanthii Fructus），始载于《神农本草经》，是菊科植物的成熟带总苞果实，其味苦、辛，性温，归肺经，有毒，具有通鼻窍、除湿止痛、祛风散寒之功效，主要用于治疗鼻渊、风寒头痛以及湿痹等病证[1-4]。其成分复杂，主要包括酚酸类、木脂素类、黄酮类以及氨基酸类等[5-9]。现代药理学研究[10-12]表明，其成分具有抗过敏、抗炎、抑菌以及抗肿瘤等作用，但其毒性也不容忽视。《本草品汇精要》《本草新编》等中医古籍也记载，苍耳子有毒。现代临床与毒理学研究[13-15]表明，苍耳子的毒性成分主要是苍术苷、羟基苍术苷、毒蛋白、倍半萜内酯类、氢醌以及羧基苍术酸钾等，其产生毒性的主要机制是脂质过氧化反应、胆汁淤积、线粒体损伤，此外还会抑制ADP∕ATP 对蛋白质在体内的转运，影响机体代谢并具有肝肾毒性等[14-18]。苍耳子对机体的毒性作用并非单一途径，而是多条途径、多靶点共同作用的结果。苍耳子的主要毒性表现在应用中患者出现恶心、呕吐、心悸、呼吸困难，甚者出现实质性脏器损伤，其中尤以肝肾损伤较为严重[19-22]，可导致死亡。苍耳子作为中药，具有多成分、多靶点的特征，难以用单一角度去解释其毒理作用。其使用要注意炮制、服用剂量以及服用周期等[23]。

本研究采用网络毒理学[24]的方法，通过构建网络模型，从多角度对其毒理作用机制进行了研究，以期更好地指导临床合理应用苍耳子。

1 资料与方法

1.1 数据库及软件工具中国系统药理数据库与分析平台[25]（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，www.tcmspw.com∕tcmsp.php）、Uniprot数据库[26]（www.uniport.org）、比较毒物基因组学数据库[27]（Comparative Toxicogenomics Database，CTD，http：∕∕ctdbase.org∕）、Pub Chem 数据库（https：∕∕pubchem.ncbi.nlm.nih.gov∕）、Swiss Target Prediction 数据库[28]（http：∕∕www.swisstargetprediction.ch∕）、STRING 数据库[29]（https：∕∕string-db.org∕）、生物学信息注释数据库[30-31]（The Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery，DAVID 6.8，https：∕∕david.ncifcrf.gov∕）以及cytoscape 软件（version 3.7.2）。

1.2 苍耳子成分筛选TCMSP是基于系统药理学的研究方法，对药物化学、药物代谢动力学以及药物-成分-靶标网络-疾病网络进行整合的分析数据库。CTD数据库提供了影响人类化合物的数据信息，首先为全球研究人员提供了不同类型分子和生物体的毒理学数据。从TCMSP 中获取苍耳子目前已知的成分，进一步根据生物利用度（OB≥30%）、类药性（DL≥0.18）获得符合要求的化合物。通过CTD 数据库将TCMSP数据库筛选出的苍耳子的成分进行查询，获得苍耳子的有毒化合物。

1.3 毒性化合物的候选靶点选取Swiss Target Prediction数据库是一个根据化合物的2 D和3 D结构精准预测化合物作用靶点信息的数据库。使用PubChem 数据库查询从CTD 数据库中获得的有毒化合物，将化合物的Canonical SMILES 输入Swiss Target Prediction 数据库中，限定物种为人，得到靶点蛋白与Uniprot ID。使用uniprot数据库的Uniprot KB功能，得到靶点基因，将其作为TCMSP 数据库已获得靶点的补充。

1.4 毒性成分-靶点网络构建获得苍耳子的毒性成分及其相关靶点后，构建毒性成分-靶点网络。并使用Cytoscape 3.7.2软件使其可视化。

1.5 靶点蛋白网络（protein-protein interaction，PPI）构建使用STRING 数据库，将苍耳子的有毒成分与成分相对应的靶点导入其中。选择人作为其物种，获得靶点蛋白网络关系互作图，保存其TSV格式，保存其格式中的node 1、node 2与Combined score。导入cytoscape 3.7.2，并进一步调整节点和相连线段的大小与颜色以反映度值（degree）的大小，以获取PPI。

1.6 代谢通路与生物过程分析使用DAVID 6.8 数据库将苍耳子毒性成分对应靶点的基因进行基因本体（Gene Ontology，GO）生物过程（biological process，BP）功能富集分析与京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，并选择人作为物种，得到苍耳子影响的代谢通路。

2 结果

2.1 苍耳子成分筛选从TCMSP 数据库中获得苍耳子目前已知的活性成分111种，筛选出具有良好的口服生物利用度（OB≥30%）与类药性（DL≥0.18）的化合物11 个，见表1。从CTD 数据库中共获取7 种苍耳子目前已知的有毒成分，见表2。

2.2 毒性成分靶点查询结果苍耳子的7 种有毒成分从TCMSP 数据库和SwissTargetPrediction 数据库中共得到367 个靶点蛋白，去除重复蛋白后获得215 个靶点蛋白。

表1 苍耳子成分筛选

表2 苍耳子中的毒性化合物

2.3 毒性成分-靶点网络构建将苍耳子的毒性成分和其相关作用靶点导入Cytoscape 3.7.2 中，构建毒性成分-靶点网络。共有222个节点（215个靶点蛋白和7 个有毒成分）与367 条边。紫色三角形表示有毒活性成分，绿色方形表示不同成分的同一靶点，蓝色八边形表示同一成分的不同靶点，见图1。节点的重要性用degree 值与介数中心性（Betweenness Centrality）来反映，见表3。

2.4 靶点PPI 构建将得到的苍耳子的215 个靶点导入STRING 数据库里，共有169 个靶点蛋白发生相互作用，共有2802 条代表靶点蛋白相互作用的边。节点越大与之相对应的degree值就越大，节点颜色由蓝变橙对应的degree值也越大。见图2。

2.5 生物过程与通路分析使用DAVID 6.8 数据库对苍耳子的215个靶点基因进行GO生物学过程富集分析和KEGG 信号通路富集分析。筛选得到GO_BP条目392 个（P＜0.05）和KEGG 信号通路91 条（P＜0.05），按照P值从小到大排列，前10 条主要生物过程和前15条的信号通路富集分析分别见表4和表5。

图1 苍耳子毒性化合物-靶点网络

表3 苍耳子主要毒性成分的网络拓扑学参数

3 讨论

3.1 苍耳子毒性成分-靶点网络构建结果分析本研究在获得苍耳子的有毒成分与靶点后，构建毒性成分-靶点网络，获得PTPN 1、BCHE、CHRM 2 等节点degree值较高的靶点蛋白。

Degree 值 为5 的PTPN 1（Protein Tyrosine Phosphatese Non-receptor type 1），又称PTPIB，是一种以调节络氨酸磷酸蛋白的磷酸化来发挥其功能的蛋白络氨酸磷酸酶，可以调节细胞的增殖、生长、分化以及凋亡等过程的多个信号通路。PTPN 1 的异常会导致阿尔兹海默症、肿瘤、肝损伤[32-34]等多种疾病的发生和发展，苍耳子引起的肝损伤可能与此有关。

Degree 值为5 的丁酰胆碱酯酶（butyrylcholinesterase，BCHE），是由肝脏合成的，广泛存在于血浆、神经胶质细胞的胆碱酯酶，与糖尿病以及精神系统疾病等有关。据文献[35-36]报道，激活胆碱能通路能缓解炎症反应导致的脏器损伤，苍耳子导致的肝肾功能损伤可能与此有关。

Degree 值为5 的CHRM 2，可调节钙离子或钾离子通路，从而影响神经元的兴奋性，可能会引起抑郁症等病[37-38]。

3.2 苍耳子有毒成分对应靶点PPI 构建结果分析由苍耳子有毒活性成分对应靶点互作网络可得到其中degree 值较高的靶点蛋白，如MAPK 3、TP 53 以及EGFR 等，苍耳子可能通过这些靶点蛋白而产生毒性作用。

Degree 值为77 的是丝裂原活化蛋白激酶3（mitogen-activated protein kinase 3，MAPK 3）。丝裂原活化蛋白激酶是细胞的重要传递者，对细胞生长、分化具有调节作用，还能调节细胞的应激反应、炎症反应等多种细胞过程。其异常表达会导致多种疾病的发生、发展（如肿瘤、胆汁淤积等）。从CTD 数据库中得知，某些药物还会通过此靶点造成肝肾功能损伤[39-40]。

图2 靶点蛋白相互作用网络图

表4 生物过程富集分析结果

Degree 值为72 的是细胞肿瘤抗原53（Tumor Protein 53，TP 53），位于17 号染色体上。其主要功能是调节细胞分裂与增殖、维护基因的完整性与促进细胞凋亡。TP 53 的异常会诱导多种肿瘤的发生和发展，此外，苍耳子造成的肝肾损伤与TP 53 也有一定关系[41-42]。

Degree 值为69 的是表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）。EGFR 作为信号传导的受体，其功能是调节细胞的生理、生化过程，与肿瘤密切相关。此外，EGFR的异常会影响呼吸系统、泌尿系统以及消化系统的正常功能[43-44]。

表5 KEGG信号通路富集分析结果

3.3 苍耳子毒理作用机制及原理分析在临床应用中，苍耳子的不良反应主要有：以恶心、呕吐为主要表现的消化系统功能损害；以呼吸困难、咳嗽为主要表现的呼吸系统功能损害；以少尿、血尿、蛋白尿为主要表现的泌尿功能损害；以头晕、昏迷为主要表现的神经系统功能损害；以血压升高和心悸为主要表现的循环系统功能损伤。此外，苍耳子外用还会出现局部瘙痒和红肿等毒性作用[15]。GO 生物过程富集分析结果表明，苍耳子可能通过调节多种生物过程而产生毒性作用。通过KEGG通路富集分析得出，苍耳子可能通过氮素代谢、雌激素信号、钙离子信号、TNF信号以及cAMP信号等通路而产生毒性。

氮素代谢（nitrogen metabolism）是机体内一种重要的合成与代谢生理途径，对维持细胞内外的稳态起着重要的作用[45]。从CTD数据库得知，多种疾病的发生、发展与此有关。

雌激素信号通路不仅与维持雌性机体的第二性征有关，还与骨质疏松、乳腺癌以及心血管疾病的发生和发展有很大关系。此外，还可通过调控多个基因（如ADCY 5、ITPR 1、EGFR），造成肝肾功能损伤及对循环系统产生影响[46-47]。

细胞内外钙离子的浓度与细胞生理活动和维持细胞的存活密切相关。某些药物可破坏细胞膜的通透性以及细胞膜上相关的酶，导致细胞内外钙离子的浓度改变，从而引起血压升高、肝肾损伤等一系列生理病理改变。苍耳子亦可能通过调控钙离子信号通路导致毒性的发生发展。

肿瘤坏死因子（TNF）信号通路不仅参与杀伤肿瘤细胞，还与全身炎症反应有关。肝肾功能损伤和胆汁淤积等多种生理损伤可能与TNF 信号通路有关[48-49]。此外，有研究[50]证实，TNF 会导致肝损伤小鼠的肾小球滤过率降低。

综上，苍耳子对机体的毒性作用是多种组分经多条途径、多种靶点而产生的。本研究使用网络毒理学的方法报告了苍耳子对人体可能产生的毒性机制和途径，对今后苍耳子的研究与临床应用具有一定的意义。