基于网络药理学技术解析海马“壮阳、益精”功效的物质基础、潜在靶点与分子机制※

●万慧琪 李知瑾 许光辉，▲ 郑乐云 林金波

海马（Haima，拉丁学名:hippocampus）为脊索动物门硬骨鱼纲海龙科海马属动物，是我国传统的名贵中药材，素有“南方人参”的美誉[1]；味甘、咸，性温，归肝、肾经，具有温肾壮阳、益精种子、止咳平喘、活血通脉、散结消肿之效，主治肾阳不足所致诸证[2]。药理研究证实，海马具有性激素样作用、抗疲劳、抗氧化、提高机体免疫力、抗肿瘤、镇静安神等药理活性[3]。

近年来，随着我国海马养殖技术的日渐成熟，我国福建、广东等沿海部分地区已实现了海马的规模化养殖[4]。海马的工厂化养殖，解决了长期以来药用海马基原不清、质量难控等难点，推动了海马的进一步开发利用。本研究针对目前海马“壮阳、益精”功效的药物应用热点[5]，采用网络药理研究方法，筛选海马的物质基础及作用靶点，明确海马发挥壮阳、益精功效的分子机制，为海马的深度开发提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 相关数据库与软件中国知网（https://www.cnki.net/）；Medline数据库（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/）；Bubchem 数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）；GeneCards 数据库（https://www.genecards.org/）；STRING 数据库（https://string-db.org/）；DAVID 6.8 数据库（http://david.abcc.ncifcrf.gov/）；RCSB BDB 数据库（https://www.rcsb.org/）；Cytoscape v3.8.0 分析软件（https://cytoscape.org/）。

1.2 海马主要化学成分与“壮阳、益精”功效相关疾病靶点数据集构建以CNKI、Medline 等数据库及相关学术资料为主要数据来源[6-9]，对《中华人民共和国药典》[10]所收录的5 种海马的主要化学成分及其含量进行收集、归类，取化学成分合集建立海马化学总成分集；根据化合物的含量、口服吸收利用度和靶点数目等指标，组成本研究所需的海马主要功效成分集。

现代药理研究表明，海马补肾壮阳功效主要体现在改善勃起功能障碍（ED）和弱精症（AS）两个方面[11-12]。本研究通过Gene card 数据库获取ED 和AS对应靶标，构建中药海马“壮阳、益精”功效相关的疾病靶点数据集。

1.3 海马“壮阳、益精”功效潜在靶点筛选利用在线软件Venny2.1.0 (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)获取海马主要功效成分集与ED、AS疾病靶点数据集的交集数据，并绘制相应的韦恩图。

1.4 “药物-疾病共有靶点”相互作用分析应用在线STRING 平台（https://string-db.org/），分别对海马“壮阳、益精”功效潜在靶点进行相互作用关系分析。应用Cytoscape 3.8.0 软件构建靶点蛋白交互网络图（BBI），计算相应的网络拓扑参数，以度值大于中数的节点为核心节点。

1.5 核心靶点的基因本体（GO）与信号通路(KEGG)富集分析将筛选的核心靶点上传至DAVID 6.8 在线数据分析平台（https://david.ncifcrf.gov/）进行GO 和KEEG 富集分析，以P<0.01 为显著差异筛选海马“壮阳、益精”功效潜在靶点涉及的生物过程和信号通路，分析其分子机制。

2 结果

2.1 海马“壮阳、益精”功效成分筛选现有文献检索结果表明，5种海马共有的化学成分以氨基酸、脂肪酸、甾体和磷脂等化合物为主，其中水解氨基酸平均含量高达海马干重的64.2%[13]，其次是脂肪酸，约占海马干重的2.9%～4.8%，甾体类约占海马干重的0.33%～0.78%[14]。根据成分含量、口服生物利用度（OB）、类药性（DL）及参与调节相关基因的数目（Number of related genes）等指标综合筛选，纳入氨基酸21 种、脂肪酸14 种、甾体类7 种和磷脂5 种等4 大类化合物进行网络药理分析。见表1。

表1 海马主要化学成分

2.2 海马“壮阳、益精”功效潜在靶点筛选通过检索Gene card 数据库，获得海马中47 种主要成分对应5764 个相关靶点，分别与1000 个ED 对应靶标和145个AS 对应靶点取交集，得到海马-ED 潜在靶点（Haima-ED）590个、海马-AS潜在靶点（Haima-AS）54个。见图1。

2.3 海马“壮阳、益精”功效靶点PPI分别将筛选到的海马“壮阳、益精”功效靶蛋白上传至String 平台进行网络互作分析。BBI结果表明，海马“壮阳”功效BBI网络节点576 个，平均度值为40.2，11567 条边，中心介数0.454，P<1.0E-16；以度值高于平均值、介数低于平均值为标准，筛选得到核心靶标218 个。海马“益精”功效BBI 网络节点54 个，平均度值为3.7，100 条边，中心介数0.56，P<1.0E-16；以度值高于平均值、介数低于平均值为标准，筛选得到核心靶标19 个。见图2。

图1 海马主要化学成分对应靶基因与ED、AS相关基因交互情况

图2 海马“壮阳、益精”功效靶蛋白相互作用网络图

2.4 海马“壮阳、益精”功效核心靶标GO 富集分析结果海马“壮阳”功效核心药效靶点，共富集59 个生物过程（BB），涉及52 个细胞组分和48 个分子功能（MF），见图3；海马“益精”功效核心药效靶点，共富集12个生物过程，涉及7种细胞组分和4种分子功能，见图4。

图3 海马“壮阳”功效核心靶标GO富集分析图

图4 海马“益精”功效核心靶标GO富集分析图

2.5 海马“壮阳、益精”功效核心靶标KEGG 信号通路富集分析结果应用DAVID 6.8 生物信息在线分析平台，分别对海马的218个“壮阳”功效核心靶点和54个“益精”功效核心靶点进行KEGG通路富集分析。根据P<0.01 和FDR<0.01 对88 条海马“壮阳”功效通路和6条海马“益精”功效的主要通路进行富集筛选，结果表明:（1）海马“壮阳”功效核心通路39 条，对应四类主要功效成分，共有核心靶点基因133 个，包括氨基酸类成分对应靶标123个，脂肪酸类成分对应靶标81个，甾体类成分对应靶标74个，磷脂等成分对应靶标95个。其中，排名前5的信号通路对应的核心靶点最多，分别为癌症发生信号通路（pathways in cancer）、磷脂酰肌醇3激酶信号通路（BI3K-AKT）、神经内分泌及神经信号传递（Neuroactive ligandreceptor interaction）、细胞因子相互作用（Cytokinecytokine receptor interaction）和Rap1 信号通路（Rap1 signaling pathway）。（2）海马“益精”功效核心通路2条，对应四类主要功效成分，共有核心靶点基因7个，包括氨基酸类成分对应靶标7个，脂肪酸类成分对应靶标3个，甾体类成分对应靶标6个，磷脂等成分对应靶标2个。其中，涉及的核心通路分别为青春晚期糖尿病（Maturity onset diabetes of the young）和2 型糖尿病（Type II diabetes mellitus）。见图5。

2.6 海马“壮阳”“益精”功效的主要成分及参与的核心通路共有35种主要化学成分协同发挥了“壮阳”功效的药理作用，主要成分包括14种氨基酸、10种脂肪酸、7种甾体和4种磷脂。其中,有12种核心功效成分参与10个以上靶基因的调节，分别为丝氨酸、酪氨酸、丙氨酸、精氨酸、二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸、二十碳四烯酸、胆固醇、磷脂酰胆碱、神经鞘磷脂、溶血磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺。共有22种主要化学成分协同发挥了“益精”功效的药理作用，主要成分包括9种氨基酸、5种脂肪酸、4种甾体和4种磷脂，分别为亮氨酸、丝氨酸、酪氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、脯氨酸、缬氨酸、组氨酸、二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸、二十碳四烯酸、十八碳二烯酸、十四烷酸、胆固醇、胆甾-4-烯-3-酮、3β-羟基-胆甾-5烯-7-酮、胆甾-5-烯-3β、7α-二醇、磷脂酰胆碱、神经鞘磷脂、溶血磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺。

图5 海马“壮阳、益精”功效核心靶标KEGG通路图

3 讨论

海马在我国及东南亚各国药用历史悠久，其“补肾壮阳”的功效广泛被认可，历版《中华人民共和国药典》均收载了海马“温肾壮阳”的功能主治[15-16]。本研究对《中华人民共和国药典》2020 版所收录的5 种海马的47 种共有主要化学成分纳入研究，主要有氨基酸、脂肪酸、甾体和磷脂等4大类成分，其中氨基酸类成分数量及含量占比最高，网络药理学研究结果表明氨基酸、脂肪酸、甾体和磷脂等4类成分均为海马“壮阳、益精”功效的物质基础。

研究表明，在治疗勃起功能障碍方面，海马粉末可显著提高大鼠的性交能力和性功能，海马壮阳胶囊也可以增强大鼠的交配能力[17-18]。在治疗弱精方面，海马乙酸乙酯提取物具有减轻良性前列腺增生症状并逆转弱精症[19]。从文献查阅中可知，在海马壮阳、益精药理作用上，主要的有效部分是海马粉末和粗提物。本研究通过网络药理学分析发现，根据成分含量、口服生物利用度、类药性及参与调节相关基因的数目等指标综合筛选出的21 种氨基酸类化合物、14种脂肪酸类化合物、7 种甾体类化合物和5 种磷脂类化合物具有壮阳、益精的作用，这为海马壮阳、益精药理作用提供了有效的物质基础。

氨基酸在机体的含氮代谢、蛋白质合成和更新中占重要地位，并参与激素、酶、维生素和其他生物活性物质的合成。氨基酸的不足不仅导致精子生成障碍，而且严重影响精子的抗原活性。游离氨基酸参与活动精子的细胞代谢，是能量补充源，可以促进其活性，降低毒素的有害作用；必需氨基酸是合成核酸的重要原材料，补充必需氨基酸将改善机体合成核酸的能力，从而促进生精能力[20]。其中，酪氨酸参与调节激素水平和细胞代谢过程；精氨酸最显著的特点是产生NO以维持机体氮平衡，与动物的繁殖性能有关；天冬氨酸盐是机体氮的来源之一；赖氨酸可调节NO 的合成；甘氨酸作为核酸的组成成分之一，与精子的质量和数量有关[21]。据报道，口服补充L-精氨酸可显著增加大鼠阴茎组织NO水平和NOS活性[22]。彭建平等人通过给大鼠口服高剂量L-瓜氨酸8周，显著增强了大鼠阴茎的勃起功能[23]。研究表明，严重ED 患者血清L-精氨酸水平明显低于轻度ED 患者[24]；体外L-精氨酸孵育可改善老龄大鼠海绵体对乙酰胆碱刺激的舒张反应[25]；口服L-精氨酸可改善男性不育患者的精子质量和勃起功能[20]。此外，氨基酸复配维生素能够提高精子质量[26-28]。本世纪初，我国研制出了主要由精氨酸氨和硫酸锌组成的复方氨基酸，临床试验结果显示其对AS有一定的疗效[29]，进一步证实了氨基酸类成分的“壮阳、益精”功效。除氨基酸类成分外，脂肪酸、甾体及磷脂等成分在治疗ED 和AS 方面也发挥了重要的作用。磷脂是动物和人体细胞膜的重要组成部分，具有强精益肾，提高机体免疫功能，保肝补血等作用，还与机体的生殖生理和激素的代谢密切相关[30]。脂肪酸和胆固醇是各种生物膜的重要组成部分，它们的缺失会致使精子受损[31]，其中，二十二碳六烯酸是前列腺及精子的主要物质基础[32]。日本学者曾报道海马乙醇提取物能使雄鼠前列腺、精囊、提肛肌的重量明显增加，具有雄激素样作用[32]，证实了脂肪酸、甾体、磷脂等成分改善ED和AS的药理作用。

综上，本研究对海马“壮阳、益精”的功效物质基础、潜在靶点和分子机制进行了初步解析，并为海马的现代药理的进一步研究指明了方向。