红黑二丸甾醇提取物通过非钙依赖磷脂酶A2介导的抗心肌细胞缺氧复氧损伤研究※

● 姚 勇 江 巍 李玉山 黄德斌 万 星▲

红黑二丸甾醇提取物通过非钙依赖磷脂酶A2介导的抗心肌细胞缺氧复氧损伤研究※

● 姚 勇1*江 巍1李玉山2黄德斌2万 星2▲

目的：探讨红黑二丸甾醇提取物抗心肌细胞H/R损伤的作用与机制。方法：western blot检测不同H/R时间点iPLA2蛋白的表达，确定H/R的时间点；在H/R的基础上，用不同浓度梯度的红黑二丸甾醇提取物处理细胞，western blot 检测iPLA2蛋白表达，MTT法检测细胞存活率，试剂盒检测LDH、SOD、MDA、TNF-α的含量，流式细胞术检测凋亡。结果：H60min/R30min，iPLA2蛋白表达最高(P<0.01)，红黑二丸甾醇提取物量效依赖地降低了其蛋白表达，同时降低H/R时LDH、MDA、TNF-α的含量，减少凋亡，提高SOD的活性及细胞的存活率(P<0.05)。结论：红黑二丸甾醇提取物能通过iPLA2量效依赖地抗心肌细胞H/R损伤。

红黑二丸 甾醇 缺氧复氧 非钙依赖磷脂酶A2

心肌缺血再灌注(I/R)损伤是一个复杂的多因素参与的病理过程，钙超载、氧自由基、能量代谢障碍、炎症反应等均参与了损伤过程[1，2，3]。非钙依赖磷脂酶A2(iPLA2)水解膜磷脂生成花生四烯酸(AA)和溶血磷脂(LPC)[4]。AA继而介导下游一系列的炎症反应，LPC则能够作用离子通道，如L-型钙通道、RyR2等[5]发挥效应。故本文用缺氧复氧(H/R)模拟心肌I/R时，以iPLA2为药物研究靶点。早期对I/R损伤的治疗主要针对钙超载上，单方面治疗效果不甚理想，因此需开发更为有效的药物。红黑二丸(RhizomaetHerbaBegoniaeSinensis，RHBS)是中华秋海棠植物的根茎，中华秋海棠为民间中草药，其味甘苦，具有活血止血、清热解毒的功效，常用于跌打损伤、痢疾肠炎腹痛等疾患[6]。有关此药的研究甚少，目前报道的药理功能有：改善微循环、抗炎镇痛、抑菌和降血脂[7-9]。本文选取红黑二丸甾醇提取物，探讨其抗心肌H/R损伤的作用及靶点。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及主要仪器 ①材料与试剂：H9C2心肌细胞株(ATCC，美国)；DMEM高糖培养基(Gibco，美国)；iPLA2rabbit polyclonal antibody(Abcam，英国)；乳酸脱氢酶、超氧化物歧化酶、丙二醛试剂盒(南京建成生物公司，中国)；大鼠TNF-αElisa试剂盒(R&D，美国)；MTT(Amresco，美国)；AnnexinⅤ PE/PI凋亡试剂盒(Biolegend，美国)。②主要仪器：CO2培养箱(Sanyo，日本)；核酸蛋白测定仪(BIO-RAD，德国)；垂直电泳仪(BIO-RAD，德国)；多功能酶标仪(Molecular Devices，美国)；流式细胞仪(Beckman，美国)。

1.2 实验分组及模型的制作 组别包括正常组、H/R组、DMSO溶剂组(10-3M)、红黑二丸甾醇提取物低、中、高剂量组。红黑二丸甾醇提取物低、中、高剂量分别为：0.11g/kg，0.22g/kg，0.66 g/kg，所需浓度均由10-3M DMSO稀释。H/R组：即缺氧时换用缺氧液后置缺氧箱中37℃密闭培养，后换用培养基按常规培养条件复氧。实验过程中，缺氧液、缺氧盒和培养器皿均用氮气充分饱和，以驱逐空气。正常组：细胞培养时间与H/R总时程一致。DMSO溶剂组和药物组：缺氧液和复氧液中给予相应浓度的药物，其他条件同H/R组。缺氧液成分：NaCl 8.01g，KCl 0.894g，MgC12·6H2O 0.1g，CaCl20.1g，HEPES 0.953g，Na lactate 2.24mL；加ddH2O至1000mL，调pH值至6.2。

1.3 红黑二丸甾醇类物质提取 将药材洗净晾干，粉碎后过60目筛，以料液比1：24加入萃取溶剂乙酸乙酯进行萃取，提取温度55℃，提取时间52min，然后将萃取部位超声处理1h，最后抽滤取清液，并测定甾醇的含量[7]。

1.4 Western blot检测iPLA2[10]心肌细胞株接种至直径7cm的培养皿中，待铺满皿底，给予相应处理后，每皿加100μL裂解液(10mmol/LTris-buffered saline，1mmol/LEDTA，2mmol/Lsodium orthovanadate，0.2 mmol/LPMSF，2μg/mLleupeptin，2μg/mLaprotinin，and 1% Triton X-100)冰上裂解30min，12000r/min、4℃离心收集上清液。BCA法测蛋白浓度。配制相应浓度的SDS-PAGE分离胶，以60V、15min转至100V、1h条件电泳，100V，75min湿转。用5%(质量分数)脱脂奶粉封闭1h，一抗预敷，4℃过夜，iPLA2一抗稀释比为V(iPLA2抗体)：V(TBST)=1∶500。次日，TBST洗膜3次，每次10min，二抗室温孵育2h，iPLA2二抗稀释比为V(羊抗兔二抗)：V(TBST)=1∶40000，再洗膜3次，每次10min。滴加V(过氧化物)∶V(Luminol/增强剂)=1∶1的Ecl化学发光试剂，暗室曝光。

1.5 LDH、SOD、MDA、TNF-α的测定 细胞接种至直径7cm的培养皿，H/R或相应处理后，用PBS清洗干净，加330μL裂解液破碎细胞，12000r/min、4℃离心15min收集上清液，SOD上样30μL，按试剂盒说明操作，MDA上样135μL，按说明书计量减半操作。LDH、TNF-α测定时，则将细胞接种在24孔板，取复氧后的细胞培养上清，按ELISA说明检测。

1.6 MTT法测细胞存活率 将培养至3～5代的细胞以0.125%(质量分数)胰酶消化，接种至96孔板，每组设6个复孔，用培养基将细胞密度调成1×105/孔，待细胞融合至70%时，按上述分6组，等细胞复氧结束后，每孔加入MTT(5mg/mL)20μL，置培养箱中孵育4小时，吸弃培养基，加入DMSO 150μL，室温避光振荡15min，使结晶充分溶解，酶标仪于492nm波长处测OD值，每组取平均值。

1.7 AnnexinⅤ PE/PI测细胞早晚期凋亡 细胞以一定密度接种至6孔板，48h铺满皿底后，按上述分组进行造模或者给药处理后，每孔加1mL胰酶消化，离心后去上清，加PBS洗净再离心去上清，加100μL AnnexinⅤ Binding Buffer重悬，转移至5mL的EP管。加5μL AnnexinⅤPE，10μL PI，轻轻混匀，室温(25℃)避光孵育15min，每管加400μL AnnexinⅤ Binding Buffer，混匀，送流式细胞仪检测。

2 结果

2.1 不同H/R时间iPLA2蛋白的表达 随着缺氧时间增加，iPLA2蛋白逐渐增加，至H60min/R30min时，其表达最高(P<0.01)，后逐渐降低至正常。见图1。

图1 心肌H/R时iPLA2蛋白的时效关系(western blot条带图和对应的灰度比)(n=6)

注：与正常组比*P<0.05，**P<0.01。

2.2 红黑二丸甾醇提取物对H/R损伤的影响 心肌细胞H60min/R30min时，LDH、MDA、TNF-α显著性增高，SOD活性及细胞存活率下降，早期凋亡细胞增多(P<0.01)，低中高浓度的红黑二丸甾醇提取物干预后，量效依赖地降低了LDH、MDA、TNF-α的表达，提高了SOD的活性，提高细胞存活率，减少早期凋亡的产生(P<0.05)。见表1、图2、图3。

表1 红黑二丸甾醇提取物对LDH、SOD、MDA、TNF-α的影响(n=6)

注：与H60min/R30min组比较，*P<0.05；与正常组比较，**P<0.01。

图2 红黑二丸甾醇提取物对细胞存活率的影响(n=6)

图3 红黑二丸甾醇提取物对细胞早晚期凋亡的影响(n=6)

2.3 红黑二丸甾醇提取物对iPLA2的影响 心肌细胞H/R时，iPLA2显著性增高(P<0.01)，低中高浓度的红黑二丸甾醇提取物干预后，量效依赖地降低了iPLA2的表达(P<0.05)。见图4。

图4 红黑二丸甾醇提取物对iPLA2蛋白的影响(western blot条带图和对应的灰度比)(n=6)

注：与H60min/R30min组比较，*P<0.05；与正常组比较，**P<0.01。

3 讨论

心肌缺血再灌注(I/R)损伤是一个复杂的多因素参与的病理过程，早期对I/R损伤的治疗主要针对钙超载上，单方面治疗效果不甚理想，因此，需开发更为有效的药物。天然药物作为重要的药物资源越来越受到重视。本文选择红黑二丸甾醇为研究对象，旨在开发更为有效的抗I/R损伤的药物。用心肌细胞H9C2H/R模拟心肌I/R损伤，检测红黑二丸对LDH、SOD、MDA、TNF-α、细胞存活率及凋亡的影响。结果表明：红黑二丸甾醇提取物量效依赖地降低了H/R时LDH、MDA、TNF-α的含量，提高SOD的活性，提高细胞存活率并减少凋亡发生。提示红黑二丸甾醇能保护心肌细胞抗H/R损伤。

心肌缺血时，心肌肌膜的破损导致细胞功能错乱，会进一步加重损伤的发生，而iPLA2在磷脂的维持和修复程度上发挥关键作用[11～13]；同时，炎症反应也是心肌缺血的一个重要病理机制，iPLA2水解膜磷脂产生的AA是最重要的的炎症因子，AA会激发下游一系列炎症通路放大炎症效应，已有文献报道iPLA2参与了心肌I/R损伤。所以结合红黑二丸的抗炎作用，本文选择iPLA2作为其靶点(复氧时间固定为30min短时间，是因为长时间复氧，凋亡加重，caspase-3会酶切iPLA2[14])，观察红黑二丸能否抑制其表达，结果表明：红黑二丸甾醇提取物量效依赖地降低了iPLA2蛋白的表达，提示iPLA2可能是红黑二丸抗H/R损伤的作用靶点，为其临床应用提供科学依据。

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国家自然科学基金(NO.81360654)

姚勇，男，副主任医师，主要从事疼痛介入研究。

▲通讯作者 万星，E-mail：504810759@qq.com

1.湖北省恩施州中心医院(445000)；2.湖北民族学院医学院(445000)