黄柏抑菌成分超声波提取工艺研究

吕君一潘健于佳霖于洋*（辽宁省沈阳市第二中学0866；沈阳农业大学生物科学技术学院）

黄柏抑菌成分超声波提取工艺研究

吕君一1潘健2于佳霖2于洋2*
（1辽宁省沈阳市第二中学110866；2沈阳农业大学生物科学技术学院）

采用超声波法提取黄柏中抑菌成分，实验证明其对西瓜枯萎病菌具有明显的抑制作用。以生长速率法测定抑菌率，通过单因素试验和正交试验考察了溶剂浓度、料液比、超声时间、超声功率和提取次数等因素对黄柏提取物抑菌效果的影响，结果表明，采用85%乙醇作为提取溶剂、料液比为1∶25、超声时间15min、超声功率800W、连续提取2次的提取条件下测得的抑菌率最高、效果最好。

黄柏；西瓜枯萎病菌；分离；抑菌活性

随着人们环保意识的日益增强，对高效、低毒农药的需求也日益强烈。植物是自然界中生物活性物质的天然宝库，植物次生代谢产物在提高自身保护和生存竞争能力及协调与环境的关系中充当着重要角色［1］，如类黄酮、萜烯类、甾体、生物碱、酚类等均具有抗菌或杀虫活性。植物源农药具有高效、环境兼容性好、不易产生抗药性、易与其他农药混配等特点，成为目前国内外开发新型生物农药的主要来源之一［2］。黄柏是我国传统的中药，为双子叶植物药芸香科植物黄柏或黄皮树的树皮［3］，黄柏主产区在辽宁、吉林、河北、四川、贵外、湖北、云南等地，黄皮树分布在四川、湖北、贵州、云南、江西、浙江等地。黄柏主要成分为小檗碱、药根碱、木兰花碱、黄柏碱、掌叶防己碱等生物碱，及黄柏酮、黄柏内醑、7-脱氢豆甾醇、β-谷甾醇、黏液质等［4］。相关研究表明，黄柏提取物可抑制水稻稻瘟病原菌的孢子萌发［5］；黄柏果实提取物对小麦纹枯病菌和稻纹枯病菌具有较强的抑制作用［6］。黄柏产地丰富、易采集，针对黄柏中具有抑菌活性的化学成分，建立快速、高效提取分离与筛选鉴定活性物质的方法具有重要意义。西瓜枯萎病是生产中重要的土传病害，目前简单、快速、有效的药剂防治法仍是生产上防治该类病害的主要措施。本文报道了黄柏提取物对西瓜枯萎病菌的抑菌活性，并通过单因素、正交试验确定其最佳提取工艺，旨在为其今后应用于植物病虫害的防治提供一定的理论依据。

1　材料与方法

1.1试验材料

黄柏购自沈阳同仁堂药房。供试提取溶剂有乙醇、丙酮、乙醇丙酮混合溶剂（乙醇∶丙酮=2∶1）。西瓜枯萎病菌（Fusariumoxysporumf.sp.niveum）由中国农业科学院蔬菜花卉研究所园艺作物病害与控制研究组提供。

1.2试验方法

1.2.1黄柏抑菌活性物质的制备取粉碎的黄柏10.0g，按料液比加入一定浓度的提取溶剂，用超声波提取法提取抑菌活性物质。提取液用旋转蒸发仪浓缩，加无菌蒸馏水定容至0.25g/mL，0～4oC保存备用。

1.2.2抑菌试验取一定质量浓度的黄柏提取液1.0mL，加入9.0mL热PDA培养基，摇匀，对照组中加入等量无菌水，倒入融化的PDA培养基至10.0mL，摇匀，制成平板。接种生长一致的供试菌菌饼（Φ= 6.0mm），使菌饼带菌丝的一面贴在培养基表面，25℃下培养，分别于第4d、第7d用十字交叉法测量菌落生长直径。抑菌试验共2个处理（培养基加提取液和培养基加无菌水），每处理3次重复。菌落生长直径（mm）=菌落直径平均值-6.0mm；菌丝生长抑制率（%）=［（对照菌落生长直径-处理菌落生长直径）/对照菌落生长直径］×100。

1.2.3提取工艺的优化以抑菌率为考察指标，单因素试验乙醇浓度、料液比、超声波时间、超声波功率等因素对黄柏有效抑菌成分提取率的影响，数据分析利用SPSS11.5。结合单因素试验，选择乙醇浓度、料液比、回流时间、提取功率为影响因素，采用L9（34）正交试验表设计正交试验（见表1），优化黄柏有效抑制西瓜枯萎病菌成分的最佳提取工艺。

1.2.4最佳提取工艺的验证试验选定西瓜枯萎病进行离体抑菌试验，验证黄柏抑菌活性物质的最佳提取工艺。

表1　正交试验因素水平表

2　结果与分析

2.1黄柏不同溶剂提取物对西瓜枯萎病菌的抑制作用

乙醇、丙酮、乙醇丙酮混合液等3种溶剂的黄柏提取物对西瓜枯萎病菌菌丝生长均有一定的抑制作用（见表2）。其中，70%乙醇提取物对西瓜枯萎病菌的抑菌效果均较好，确定乙醇为提取溶剂。

表2　不同溶剂提取物对西瓜枯萎病菌的抑菌率

2.2黄柏乙醇提取物使用浓度的确定

随着黄柏提取物浓度的降低，抑菌率明显降低（见表3）。黄柏乙醇提取物质量浓度为2.00g/mL时，抑菌效果最好，但抑菌率过高不利于最佳提取条件试验的确定，为了后期试验有序进行，故选择0.25g/mL为后续试验浓度。

表3　不同浓度的黄柏提取物对西瓜枯萎病菌的抑菌率

2.3单因素试验

2.3.1乙醇浓度对黄柏提取物抑菌效果的影响取黄柏粉末10.0g，加入料液比为1∶20的不同浓度乙醇，在提取温度40℃、超声功率800w的条件下提取40min，提取2次。由表4可知，乙醇浓度为80%时，黄柏提取物对西瓜枯萎病菌的抑菌效果最佳。

2.3.2料液比对黄柏提取物抑菌效果的影响取黄柏粉末10.0g，加入不同料液比的80%乙醇，在提取温度40℃、超声功率800w的条件下提取40min，提取2次。由表5可知，当料液比为1∶20时，黄柏提取物对西瓜枯萎病菌的抑菌效果最佳。

表4　不同乙醇浓度的提取物对西瓜枯萎病菌的抑菌率

表5　不同料液比的提取物对西瓜枯萎病菌的抑菌率

2.3.3超声波时间对黄柏提取物抑菌效果的影响取黄柏粉末10.0g，加入料液比为1∶20的80%乙醇，在提取温度40℃、超声功率800w的条件下提取40min，提取2次。由表6可知，超声波时间为20min和40min时，黄柏提取物对西瓜枯萎病菌的抑菌效果均较好，且差异不显著（p<0.05），故选取超声时间为20min。

表6　不同超声波时间的提取物对西瓜枯萎病菌的抑菌率

2.3.4超声波功率对黄柏提取物抑菌效果的影响取黄柏粉末10.0g，加入料液比为1∶20的80%乙醇，在提取温度40℃、不同超声功率下提取20min，提取2次。由表7可知，当超声波功率为800w时，黄柏提取物对西瓜枯萎病菌的抑菌效果最好。

表7　不同超声波功率的提取物对西瓜枯萎病菌的抑菌率

2.4对西瓜枯萎病菌抑菌效果的正交试验

由极差分析可以看出（见表8），针对西瓜枯萎病菌，各因素影响黄柏抑菌活性物质抑菌效果的主次顺序为：乙醇浓度、料液比、超声波功率、超声波时间，即乙醇浓度影响最大，超声波时间影响较小。针对西瓜枯萎病菌提取黄柏抑菌活性物质的最佳提取工艺为A3B3C1D2，即乙醇浓度为85%、料液比为1∶25、超声时间为15min、超声功率为800w。

表8　L9（34）对西瓜枯萎病菌抑菌作用的正交试验

2.5验证试验

比较单因素最佳组合提取工艺与上述3种提取工艺的抑菌效果。由表9可知，提取工艺A3B3C1D2的黄柏提取物对西瓜枯萎病菌的4d、7d抑菌效果最佳，确定黄柏抑菌成分的最佳提取工艺为A3B3C1D2，即85%乙醇浓度、料液比为1∶25、超声时间为15min、超声功率为800w。

表93　种提取工艺的提取物对西瓜枯萎病菌的抑菌率

3　讨论与结论

近年来，从天然资源中寻找抗菌、杀虫活性物质代替化学农药已成为植物保护研究中的热点。我国有丰富的中草药资源，是开发植物源抗菌剂的理想来源。现代医学研究已表明，黄柏具有抗病原微生物、抗炎、抗溃疡、降压、抗心律失常、解热等作用［7～8］，但关于黄柏在抗植物病原菌方面的研究及应用还少见报道。

本试验确定了黄柏的乙醇提取物对西瓜枯萎病菌的菌丝生长均具有较强的抑制作用，但其具体的抑菌作用机制尚有待进一步研究。同时，通过单因素试验和正交试验确定超声波提取法提取黄柏抑菌活性物质的最佳条件为：以85%乙醇作为提取溶剂、料液比1∶25、超声时间15min、超声功率800w、连续提取2次。本研究针对黄柏提取物对西瓜枯萎病菌的抑菌活性及其提取方法方面进行了初步探索，为深入研究其抗菌活性成分，以及植物源杀菌剂和黄柏资源的开发与利用提供依据。

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