靶向结直肠癌的小白菊内酯脂质体纳米颗粒诱导程序性坏死并改善T细胞耗竭

姚婉瑜，汪枭睿，杨 雨，游俊雄，金军国，曾 平，韩钦芮，姚学清，孙学刚，周 瑾

南方医科大学1中医药学院分子生物学实验室，2生物医学工程学院广东省组织构建与检测重点实验室，广东广州 510515；3广东省人民医院，广东 广州 519041；4南方医科大学中西医结合医院，广东 广州510315

结直肠癌（CRC）是主要的消化道恶性肿瘤之一，其全球发病率在男性肿瘤中排行第3，女性肿瘤中排行第2；死亡率男女分别为第4位和第3位［1,2］。目前对于结直肠癌的治疗还缺乏持久有效的药物，因为常用的抗肿瘤药物多诱导肿瘤细胞的凋亡［3］，而肿瘤细胞常会通过上调抗细胞凋亡蛋白Bcl-2的表达来躲避细胞凋亡［4］，进而产生凋亡耐受，抑制了药物的抗肿瘤效果。此外，凋亡细胞在体内主要通过募集单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞等运动吞噬来清除细胞，而鲜少激活CD4+CD8+T细胞［5,6］，其免疫原性差导致难以提高肿瘤抗原负载来增强肿瘤微环境中的免疫应答［7,8］。因此，寻找一种不同于凋亡的死亡方式，规避肿瘤细胞凋亡耐受的同时提高其免疫原性至关重要。

肿瘤细胞内存在多种方式的死亡通路，如焦亡、铁死亡以及程序性坏死等途径［9,10］，其分子机制各不相同，肿瘤细胞为了躲避凋亡而设置的障碍对另外的死亡途径一般没有影响［11］。已有研究表明细胞程序性坏死伴随着促炎介质的产生可以促进CD8+T细胞依赖的抗肿瘤免疫，同时与免疫检查点阻断协同作用，促进持久的肿瘤清除［12］。本研究考虑选择合适的药物特异性激活坏死途径，最大限度地提高肿瘤微环境中细胞的免疫原性来提高药物对肿瘤细胞的作用。

甘菊是临床常见中药，其味苦、甘，性微寒，功擅疏散风热，消肿解毒，其主要活性成分小白菊内酯（PTL）具有较强的抗肿瘤活性，然而，目前暂无明确关于PTL诱导肿瘤细胞发生程序性坏死的相关研究。同时而且PTL在体内广泛引起细胞死亡，作为抗肿瘤药物使用时对人体存在一定的毒副作用［13］，我们拟通过构建纳米脂质体颗粒载体来负载PTL以产生对肿瘤的减毒增效作用。课题组前期发现，TCP-1是特异性靶向结直肠癌肿瘤的多肽肽段［14］。在此基础上，通过制备负载PTL的靶向纳米脂质体颗粒并探究对结直肠癌的作用效果，并进一步探讨其对CD8+T细胞的激活和耗竭的调控机制。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 6～8 周龄、体质量18～22 g 的健康C57BL/6J雄性小鼠购自广州市言诚生物科技有限公司，饲养于无特定病原体（SPF）环境，温度保持21～25 ℃，湿度保持50%～60%，小鼠自由进食进水，严格遵守实验动物管理规范。动物实验通过南方医院实验动物伦理委员会伦理审查（IACUC-LAC-20220621-012）。

1.1.2 细胞 HCT116、SW480、DLD1、IEC-6 与MC38细胞购自中科院上海细胞所，由南方医科大学中医分子生物学实验室液氮保存，常规复苏后使用。

1.1.3 材料与试剂 小白菊内酯（宝鸡辰光公司）、DSPC（Avanti）、DSPE-PEG3400-NH4（Ponsure Biological）、胆固醇（Solarbio）。

1.2 实验方法

1.2.1 动物实验

1.2.1.1 皮下瘤模型构建与分组 麻醉小鼠后固定，剃除小鼠左腿至腹股沟处毛发，暴露注射视野。使用75%酒精棉球消毒注射部位，抽取100 μL细胞悬液沿皮下缓慢进针，将MC38-luc肿瘤细胞缓慢注射至皮下。注射完成后解除固定，待小鼠苏醒后放回鼠笼中。皮下瘤实验分3组，包括模型对照组与高低剂量PTL处理实验组，8只/组，根据前期预实验结果设计低剂量组PTL剂量为5 mg/kg，高剂量组PTL剂量为15 mg/kg，采用腹腔注射给药，每天给药1次。

1.2.1.2 原位移植瘤模型构建 麻醉小鼠后固定，将小鼠腹部剃毛，在腹中线上行纵向切口，切口长度约为6 mm，逐层开腹，找到小鼠的回盲部，将之暴露于切口。选取剪切好的皮下瘤组织块，将其固定于小鼠回盲部，使用组织镊轻微划动回盲部周围肠系膜至出现点状出血。把固定好肿瘤组织块的回盲部按顺序回纳至小鼠腹腔内，逐层关腹，待小鼠苏醒后放回鼠笼中。将造模后的小鼠随机分为4组，包括模型对照组与给药处理实验组，8只/组，根据皮下瘤实验结果设计PTL单独给药组给药剂量为10 mg/kg，TCP-1-PTL-LNPs低剂量组为1 mg/kg，TCP-1-PTL-LNPs高剂量组为2 mg/kg，采用尾静脉注射给药，每天给药1次。

1.2.1.3 小鼠活体成像 给药14 d后，使用不含Mg2+和Ca2+的PBS溶解D-荧光素钾盐，通过0.2 μmol/L滤网过滤后分装于1.5 mL的EP管中配置荧光素，按照分组，将荧光素以150 mg/kg的剂量腹腔注射入动物体内，等待3 min，使得荧光素底物luc与荧光素充分反应，使用异氟烷气体麻醉小鼠，待小鼠进入深度麻醉后成像。

1.2.2 CCK8 实验 SW480、HCT116、DLD1、IEC-6 与MC38细胞常规培养，待细胞长满后消化，按1×104/孔铺于96孔板中，保持终体积100 μL/孔。使用含10%FBS的培养基RPMI 1640或DMEM进行配制给药，根据细胞处理方式不同分为5、10、15、20、25、40 μmol/L的PTL加药处理组。每组设置5个复孔。根据不同实验目的分别培养6～48 h后，使用CCK8试剂盒测定每种各组细胞的增殖状况。

1.2.3 Hoechst/PI 荧光染色 HCT116与SW480细胞消化后接种至含有灭菌盖玻片的24孔板中制备细胞爬片，培养过夜的爬片去上清，PBS清洗3次，5 min/次，加4%PFA室温固定15 min，弃固定液，PBS洗3次，5 min/次，在细胞爬片上滴加Hoechst染液（200 μg/mL），室温避光孵育5 min 后，弃染色液，继续滴加PI染液室温避光孵育10 min，弃染色液，PBS中静置5 min，封片，荧光显微镜下观察。

1.2.4 细胞凋亡流式 HCT116 与SW480 细胞常规培养消化，按1×106/mL收集细胞，用预冷PBS以11 000 r/min，5 min清洗2次后重悬，缓慢加入预冷的70%乙醇中4 ℃放置1 h，以1500 r/min，10 min离心后弃上清，预冷PBS清洗1次，加入终浓度15 μg/mL的PI染液37 ℃避光染色30 min，流式上机检测。

1.2.5 Western blot检测 弃去MC38细胞原培养基，预冷PBS清洗3次，加入含PMSF与磷酸酶抑制剂的细胞裂解液于4 ℃充分裂解30 min，刮取细胞后12 000 r/min，4 ℃，离心15 min取上清，经BCA蛋白定量法检测蛋白浓度，加入Loading buffer后98 ℃金属浴煮沸后加样，进行SDS-PAGE电泳，恒压90 V转膜1.5 h，5%BSA室温封闭2 h，加入一抗于摇床4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，8 min/次，加入二抗于摇床常温孵育1 h，TBST洗膜3次，8 min/次，随后使用凝胶成像仪显像。

1.2.6 乳酸脱氢酶（LDH）检测 MC38细胞消化后以1×104/孔接种于96 孔板中，分为对照组及5、10、15、20、25 μmol/L的PTL加药处理组，孵育12 h后加入预先配置好的LDH检测工作液孵育1 h，以400 g，5 min离心取上清，使用酶标仪进行测定。

1.2.7 活性氧（ROS）检测 MC38细胞消化后接种于6孔板中，分为对照组及5～25 μmol/L 的PTL 加药处理组。按照1∶1000用无血清培养液稀释DCFH-DA至终浓度为10 μmol/L。去除细胞培养液，加入1 mL DCFHDA，37 ℃孵育20 min，无血清细胞培养液洗涤细胞3次，按分组加入不同浓度PTL孵育6 h，收集细胞后用流式细胞仪检测DCF荧光强弱。

1.2.8 免疫组化实验 取小鼠肿瘤组织按分组制备石蜡切片，脱蜡后使用0.01 mol/L柠檬酸钠缓冲液进行抗原热修复，清洗后使用以甲醇：30%H2O2=1∶1配制的溶液浸没切片组织20 min，以消除内源性过氧化氢酶的活性，再次清洗后进行封闭和抗体孵育，孵育结束后在切片组织上滴加DAB显色液显色，常温孵育3～10 min，再使用苏木素染细胞核3～5 min，随后使用自来水冲洗切片至流水无明显颜色，再次脱水，使用中性树脂封片，待树脂完全凝固后，显微镜下拍片。

1.2.9 TCP-1-PTL-LNPs构建 取PTL、DSPE-PEG3400-NH4、胆固醇与DSPC，解冻后以PTL取2 mg的剂量将四种原料按照1∶1∶1∶3的比例分别加入EP管中，用无水乙醇彻底溶解定容为1 mL，通过微量注射泵以1 mL/h的速率加入含有9 mL无菌PBS溶液与10 μL Tween80的容器中，400～500 r/min低速搅拌，透析后使用脂质体挤出器均匀脂质体颗粒。称量TCP-1多肽干燥粉末、EDC 粉末和NHS 粉末溶解于1 mL 0.05 mol/L MES Buffer中，活化催化剂后加入挤出后的脂质体，调节pH至8.5，37 ℃水浴搅拌4 h，再次透析，透析结束后即得TCP-1-PTL-LNPs靶向脂质体。

1.3 统计学分析

采用Graph Pad prism8.0统计软件进行分析。两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用One-Way ANOVA，方差不齐采用Welch法校正。P<0.05表示差异具有统计学意义。统计图采用Graph Pad prism8.0制作。

2 结果

2.1 PTL诱导结直肠癌细胞坏死

经过PTL处理，SW480，HCT116与DLD1 3种结直肠癌细胞均出现不同程度的生长抑制，且当处理浓度提高至20 μmol/L时抑制效果较明显。其中，SW480细胞在经过24 h 刺激后显示出明显的浓度梯度抑制，DLD1细胞在刺激12 h后即出现生长抑制，而HCT116细胞经过6 h处理便出现明显的细胞活力降低（图1A）。同时，正常肠上皮细胞IEC-6在使用高浓度（40 μmol/L）PTL处理12 h后仍保持一定的细胞活力（图1B）。此外，Hoechst/PI 荧光染色结果显示随着PTL的浓度提高和处理时间增加，细胞PI阳性率明显提升（图1C、D）。

图1 PTL诱导结直肠癌细胞坏死Fig.1 Parthenolide(PTL)induces necrosis in colorectal cancer cells.A,B:CCK8 assay of SW480,HCT116,DLD1 and IEC6 cells treated with a concentration gradient of PTL for 6,12,24 and 48 h.C: Hoechst/PI fluorescence staining (original magnification:×200)of HCT116 and SW480 cells treated with a concentration gradient of PTL for 0-24 h.D:Percentage of PI.*P<0.01 vs the first group of each concentration.

2.2 高浓度PTL诱导的细胞死亡方式为程序性坏死

小鼠结肠癌MC38细胞经过PTL处理后细胞活力呈浓度依赖性下降，同时乳酸脱氢酶LDH的释放也随PTL浓度提升而增加（图2B）。对细胞内活性氧水平进行检测，流式结果显示随着处理浓度提高，细胞内活性氧含量显著增加（图2D、E）亦证实这一结论（P<0.01）。Western blot分析加入了高浓度（25 μmol/L）PTL处理不同时间的细胞蛋白可见RIP3 与MLKL 发生磷酸化（图2C）。使用细胞凋亡抑制剂Z-VAD-FMK与坏死抑制剂Nec-1与高浓度PTL共同处理细胞，结果显示当坏死通路被抑制时，PTL 对细胞的杀伤作用也被抑制，而凋亡通路的抑制与PTL对细胞的抑制无明显作用（图2F，P<0.01）。

图2 高浓度PTL诱导MC38细胞程序性坏死要求同上Fig.2 High concentration of PTL induces necroptosis in MC38 cells.A: CCK8 assay of MC38 cells treated with a concentration gradient of PTL for 24 h.B:PTL dose-dependently induces LDH leakage.C:Western blotting of necrotic proteins after 0-180 min of PTL treatment.D:Flow cytometry of MC38 cells after treatment with PTL for 24 h.E:Effects of PTL on ROS generation of MC38 cells.F:Viability of cells treated with PTL or the combination of PTL with Z-VADfmk or Nec-1.#P<0.05,＊P<0.01 vs 0 μmol/LGroup.

2.3 PTL改善肿瘤CD8+T细胞耗竭

在小鼠MC38-luc细胞皮下瘤模型中，活体成像结果显示给药组与对照组相比肿瘤荧光强度明显减弱（图3A），小鼠肿瘤组织称重结果显示PTL抑制小鼠皮下瘤生长，且随着PTL 浓度提升抑制效果愈显著（图3B，P<0.01）。取各组小鼠肿瘤进行流式细胞分析，结果显示当使用高剂量PTL治疗小鼠结肠癌皮下瘤时，肿瘤中CD3+CD8+T细胞显著增加，而低剂量处理组与模型对照组之间则无明显差异（图3C、E）。与此同时，在CD8+T细胞中，高剂量组的高耗竭（PD1hiTIM3+）CD8+T细胞与其他两组相比呈现下降的趋势，且具有统计学意义（P<0.01），与之相应的，在高剂量组中耗竭程度低（PD1loTIM3-）CD8+T细胞较其他两组相比显著增多（图3D、F）。

图3 高浓度PTL改善CD8+T细胞耗竭Fig.3 High concentration of PTL ameliorates tumor-infiltrating CD8+ T cell exhaustion.A: Tumor volume shown by fluorescence using in vivo imaging system.B: Tumor weight in the mice.C:Representative flow plots and frequency.E:Statistical chart of the expression of CD3+CD8+in the tumor in each group of mice.D:Representative flow plots and frequency.F:Statistical chart of PD1 and TIM3 in the tumor in each group.#P<0.05,*P<0.01,**P<0.01 vs Con Group.

2.4 PTL靶向脂质体增加肿瘤CD8+T细胞浸润

制备TCP-1-PTL-LNPs，对其进行表征，电镜下观察脂质体颗粒呈圆球形，大小均一，分散均匀无团聚（图4 A）。使用粒度电位分析仪分析脂质体的粒径平均为127.68 nm（图4B），电位呈中性电位（图4C），整个体系均衡稳定。小鼠原位移植瘤给药实验中，使用PTL处理的分组肿瘤重量较对照组均呈下降趋势（P<0.01，n=6），其中以使用高剂量TCP-1-PTL-LNPs的分组肿瘤重量为最低（图4D）。使用CD8抗体对各组小鼠肿瘤组织石蜡切片进行免疫组织化学染色分析，与对照组相比，PTL组的褐色染色数量增加，高剂量靶向脂质体组褐色染色数量的增加更加明显（图4E、F），统计分析免疫组化染色评分分数的结果亦证实这一结论，其中与对照组相比，PTL组的染色评分呈现上升趋势，而高剂量TCP-1-PTL-LNPs组的评分与其他3组对比都显著上升（图4 E，P<0.01）。

3 讨论

小白菊内酯来源于常见中药甘菊，是其活性提取物的主要成分。PTL的抗肿瘤活性已有明确报道，主要依赖抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡来实现［15,16］。然而由于肿瘤细胞凋亡耐受机制的存在，要使药物仅通过凋亡途径清除肿瘤显然并不现实。此前已有研究提出，过表达RIP3能够通过细胞内ROS的积累增强体外培养的乳腺癌细胞对PTL的敏感性［17］，然而关于PTL对RIP3的作用方式则缺乏进一步的研究。RIP3是细胞程序性坏死通路中的关键蛋白，RIP1/RIP3-MLKL的磷酸化是程序性坏死过程中的关键反应［18-20］。既然过表达RIP3能为PTL 的抗肿瘤效应增敏，那么PTL 是否能够诱导由RIP3介导程序性坏死呢？在本研究中，我们首先发现了小白菊内酯PTL可以诱导多种结直肠癌细胞的坏死，导致细胞出现活性氧水平和上清LDH水平的上升。接着我们进一步探究PTL诱导的细胞坏死的具体形式，发现在使用PTL处理细胞的过程中出现了RIP3和MLKL的磷酸化，同时RIP1抑制剂Nec-1可以拯救药物对细胞生长的抑制效果。这些结果均证实了我们的猜想，即PTL可以诱导结直肠癌细胞发生程序性坏死。

在肿瘤微环境中，不仅存在肿瘤细胞发生与发展，还有能够调节肿瘤的免疫细胞与起维持作用的基质细胞的存在。目前公认的最主要的发挥抗肿瘤效应的免疫细胞是CD8+T细胞［21-23］，可以通过与效应靶细胞的结合并通过激活第2信使传导信号介导对肿瘤细胞的杀伤效应。在抗肿瘤免疫研究中，通过各种方法尽可能地增加肿瘤微环境中的CD8+T细胞浸润来提高抗肿瘤效应是一个主要的研究方向。已有学者证实程序性坏死可以促进CD8+T细胞依赖的抗肿瘤免疫［12］，由此我们进一步考虑，由PTL诱导的细胞程序性坏死在体内是否能够引起相似的免疫效应？虽然已有研究证实PTL不仅可以体外抑制肿瘤细胞活力，在体内对肿瘤细胞的生长也具有一定抑制作用［24-26］，然而关于PTL在体内作用于肿瘤时肿瘤微环境中的免疫应答情况目前尚无明确研究。本研究通过构建小鼠皮下瘤模型验证了PTL在体内的抗肿瘤活性，结果显示PTL对肿瘤生长具有显著抑制作用，同时通过流式分析了肿瘤中浸润的CD8+T细胞的数量，结果显示高剂量PTL的处理能显著增加肿瘤CD8+T细胞的浸润。

显然，PTL的处理能够在体内增强CD8+T细胞依赖的抗肿瘤免疫，然而效应性CD8+T细胞存在T细胞耗竭的过程，是一种T细胞功能障碍状态，以不良的效应功能，抑制性受体的持续表达，表观遗传学特点的改变为主要特征，其中抑制性受体的表达常见为PD1、TIM3等［27-30］，如何通过改善T细胞耗竭增强抗肿瘤免疫也是众多学者的主要研究内容。在这里我们分析了肿瘤中CD8+T细胞的PD1与TIM3的表型，发现PTL能够下调PD1hiTIM3+CD8+T 细胞数量和上调PD1loTIM3-CD8+T细胞数量，改善CD8+T细胞的耗竭，从而增强抗肿瘤免疫。

虽然实验验证了PTL在体内或体外均具有良好的抗肿瘤活性，但由于PTL水溶性差，体内生物利用度低，而且对各种类型的细胞均具有一定的杀伤作用。因此，本研究选择采用具有生物相容性良好的特性的纳米药物载体脂质体来包埋PTL，通过负载PTL并提高其水溶性和稳定性以解决溶解性的难题，同时我们采用结直肠癌特异性结合多肽TCP-1修饰小白菊内酯脂质体，通过靶向多肽特异性识别结直肠癌的血管来实现癌细胞靶向提高了小白菊内酯的抗肿瘤疗效。我们通过小鼠结肠肿瘤原位移植模型，根据之前的研究结果选择使用较高浓度（10 mg/kg）的PTL单体作为阳性对照，发现高剂量PTL靶向脂质体不仅能够增加肿瘤CD8+T细胞浸润，而且对比PTL单体组，T细胞浸润程度更高，同时，我们还注意到，本实验中低剂量靶向脂质体组的PTL使用量仅为PTL单体组的1/10便已经能起到与PTL单体组相近的抗肿瘤效应，而高剂量靶向脂质体组PTL的使用量为单体组的五分之一，其效果已经比单体组显著且优越，说明该靶向脂质体不仅能够促进PTL的抗肿瘤效应，还能节约药物成本。

综上，我们认为本研究中构建的TCP-1-PTL-LNPs靶向脂质体能够增加肿瘤微环境中CD8+T细胞的浸润，改善CD8+T细胞的耗竭，进而抑制肿瘤在体内的生长，达到良好的治疗效果。