决明子总蒽醌提取物抗氟尿嘧啶致小鼠肝损伤的谱效关系

王 恒，李梦奇，李燊星，史精干，黄 莉，程索婷，邹纯才，鄢海燕

皖南医学院药学院，安徽 芜湖241002

氟尿嘧啶（5-Fu）作为一种细胞毒性化疗药物，是消化道肿瘤和乳腺癌治疗的基础药物。然而5-Fu的耐药性与全身毒性特别是肝损伤极大限制了其使用，在提高晚期肝细胞癌患者的生存率方面有限［1］。研究证明，5-Fu引起的肝损伤有多种机制，可能与炎症反应、氧化应激及肝细胞凋亡有关［2,3］。活性氧（ROS）的积累和炎症与许多不同器官的疾病产生有密切关系，抑制ROS的产生和炎症反应可以有效改善小鼠的肝细胞凋亡，另外肝脏中ROS的产生减少可以改善肝脏纤维化［4,5］。中药在减缓化学药物诱导的肝损伤方面具有极大的潜力，特别是一些具有抗氧化和抗炎活性的中药已被证实对5-Fu诱导的肝损伤显示出良好的保护作用。随着癌症患者的增多和化疗的进行，5-Fu所诱导肝损伤的病例也逐渐增多，导致患者化疗效果差。因此，寻找高效安全且低毒的药物缓解抗肿瘤药物的毒副作用至关重要。

决明子为豆科植物决明Cassia obtusifolia L.或小决明C.tora L.的成熟干燥种子，具有清热明目、润肠通便、抗氧化、降血脂等功效［6,7］，蒽醌类成分是决明子中的主要活性成分，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、保肝等药理作用［8］。查阅文献发现，决明子总蒽醌对免疫性肝损伤、脂多糖诱导的肝损伤及四氯化碳致肝损伤等多种肝损伤均具有较好的保护作用，且其机制多与氧化应激及炎症有关［9-11］，但哪些成分发挥作用尚未见相关研究。课题组前期研究结果表明，决明子总蒽醌提取物具有较好的体外抗氧化活性。中药谱效关系是在中药指纹图谱的基础上，将中药物质群中的化学成分与药效相联合，通过线性或非线性的数学处理，建立“谱-效”模型，确定中药的药效成分群［12,13］。为此，鉴于5-Fu在化疗中的普遍应用性与其临床应用中伴随的肝脏毒性，但未见有关于决明子总蒽醌提取物对氟尿嘧啶致小鼠肝损伤的保护作用研究，也未见其发挥保肝作用的药效成分或药效成分群的文献报道，本研究拟基于决明子总蒽醌抗肝损伤与氧化应激的相关性，研究决明子总蒽醌提取物抗氟尿嘧啶致小鼠肝损伤的谱效关系，为后期决明子总蒽醌提取物在预防或治疗肝损伤方面的深入研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 实验动物

昆明种雄生小鼠72只，体质量18～22 g，购于济南朋悦实验动物繁育有限公司，许可证号：SCXK（鲁）2019-0003。实验中所用动物经皖南医学院实验动物福利与伦理委员会批准（LLSC-2022-036）。实验前适应性喂养3 d。

1.2 试药

决明子（清炒品，北京同仁堂诚安药材有限公司）。决明子总蒽醌提取物由本课题组制备，制备工艺：以20倍量的60%乙醇-乙酸乙酯（2∶1）回流提取3次，15 min/次，浓缩干燥，即得。联苯双酯滴丸（万邦德制药集团有限公司）；氟尿嘧啶（山东西亚化学股份有限公司，纯度≥99%），溶解于磷酸盐缓冲液备用；谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、蛋白定量（TP）、超氧化物歧化酶（SOD）、髓过氧化物酶（MPO）和总抗氧化能力（T-AOC）试剂盒（南京建成生物）。

1.3 仪器

Multiskan Go全波长酶标仪（赛默飞世尔科技有限公司）；JW-3021HR高速冷冻离心机（安徽嘉文仪器装备有限公司）；FA2004B电子天平（上海越平科学仪器有限公司）；KNT-II-20分析型超纯水机（合肥科宁特水处理设备有限公司）；UV-5100型紫外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）等。

1.4 溶液的制备

1.4.1 决明子总蒽醌提取物溶液的制备 取决明子提取物10批，0.2 g/批，精密称定，置于100 mL圆底烧瓶中，加入稀盐酸30 mL，回流水解1 h，取出立即冷却，二氯甲烷萃取5次，30 mL/次，合并二氯甲烷液，回收溶剂，残渣用无水乙醇-乙酸乙酯（2∶1）混合溶液洗出，并定容至10 mL量瓶中［14］。

1.4.2 混合对照品的制备 取橙黄决明素、大黄酸、大黄素、大黄酚与大黄素甲醚适量，加入无水乙醇-乙酸乙酯（2∶1）混合溶液定容至刻度，得到含量为橙黄决明素45 μg/mL、大黄酸50 μg/mL、大黄素44 μg/mL、大黄酚70 μg/mL、大黄素甲醚20 μg/mL的混合对照品溶液。

1.5 决明子提取物溶液指纹图谱的构建

1.5.1 色谱条件 色谱柱YMC-PackODS-A C18（250mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为A（乙腈）-B（0.1%磷酸），梯度洗脱，分析时间80 min；0～11 min，35%～35%A；11～13 min，29%～29%A；13～19 min，35%～38%A；19～22 min，38%～32%A；22～27 min，32%～37%A；27～40 min，37%～47%A；40～44 min，47%～50%A；44～54 min，50%～55%A；54～70 min，55%～57%A；70～80 min，57%～90%A；柱温为30 ℃；体积流量：1 mL/min；检测波长254 nm。

1.5.2 化学指纹图谱的建立 通过国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012.130723 版本）对10批决明子总蒽醌提取物溶液进行共有峰匹配并建立HPLC 指纹图谱。

1.6 决明子总蒽醌提取物抗5-Fu致小鼠肝损伤的动物造模及给药

将72 只小鼠随机分为正常组、5-Fu 模型组（150 mg/kg）、决明子总蒽醌提取物低剂量组（0.4 g/kg）+5-Fu模型组（150 mg/kg）、决明子总蒽醌提取物中剂量组（0.8 g/kg）+5-Fu模型组（150 mg/kg）、决明子总蒽醌提取物高剂量组（1.6 g/kg）+5-Fu模型组（150 mg/kg）及联苯双酯组（3 mg/kg），12只/组。除正常组腹腔注射生理盐水外，其它各组小鼠均腹腔注射5-Fu（150 mg/kg/d），10 mL/kg，受试药物组同时灌胃给予药物20 mL/kg/d，正常与模型组灌胃等体积生理盐水，连续给药5 d［15］。每天记录小鼠体质量及食物量，自由饮水。末次给药2 h后，摘眼球取血并脱臼处死小鼠，摘取肝脏冻存于-80 ℃冰箱中以待后用。

1.7 血清ALT与AST检测

小鼠摘眼球取血后，置4 ℃，8000×g离心10 min，取上清液冻存于-80 ℃。按检测试剂盒测定ALT和AST含量，记录数据。

1.8 肝组织氧化指标检测

取冻存于-80 ℃的肝组织于冷生理盐水中反复冲洗，剥离结缔组织，剪碎，生理盐水洗涤除去内部积血，滤纸吸干备用。准确称取肝组织1 g，按照1∶4（M/V）的比例加入4倍体积的生理盐水，冰浴下机械匀浆充分粉碎组织，制备20%组织匀浆，取未经离心的20%组织匀浆0.5 mL置-80 ℃保存，其余组织匀浆4 ℃，12 000×g离心6 min，取上清液冻存于-80 ℃待用。通过BCA蛋白定量法测定上清蛋白浓度，严格按照检测试剂盒说明书测定肝组织中SOD、T-AOC及MPO含量。

1.9 决明子总蒽醌提取物抗5-Fu致小鼠肝损伤的谱-效关系分析

通过灰色关联度法，以Matlab 2014a 语言自编分析程序得到决明子总蒽醌提取物抗5-Fu致小鼠肝损伤的谱效关系并得到其药效成分群。

1.10 统计学分析

通过SPSS Statistics 18软件进行统计学处理，实验数据以均数±标准差表示，采用独立样本t检验，P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 决明子总蒽醌提取物指纹图谱的建立

取“1.4”项下决明子总蒽醌提取物溶液及混合对照品溶液，按“1.5.1”项下色谱条件进样，建立决明子总蒽醌提取物溶液与混合对照品溶液的色谱图（图1）。图中6号峰为橙黄决明素、11号峰为大黄酸、22号峰为大黄素、29号峰为大黄酚、30号峰为大黄素甲醚。将10批决明子总蒽醌提取物溶液色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》进行相似度评价，以S1为参照图谱，通过Mark峰匹配建立决明子总蒽醌提取物指纹图谱，共标定31个共有峰（图2）。对决明子总蒽醌提取物指纹图谱中的31个共有峰的峰面积进行均值化变换法处理［16］。

图1 决明子(A)及对照品(B)的HPLC图Fig. 1 High-performance liquid chromatograms(HPLC)of Cassia seeds(A)and the reference substance(B).

图2 10批决明子HPLC指纹图谱Fig. 2 HPLC fingerprints of 10 batches of Cassia seeds.

2.2 决明子总蒽醌提取物抗5-Fu致小鼠肝损伤的药效学分析

2.2.1 决明子总蒽醌提取物对5-Fu模型小鼠血清ALT、AST水平的影响 相较于正常组，模型组小鼠血清中ALT和AST含量均明显升高（P<0.01，图3）。与5-Fu组比较，决明子总蒽醌提取物低、中、高剂量组呈剂量依赖关系显著降低了ALT和AST的含量（P<0.05）。决明子总蒽醌提取物低、中、高剂量组详细数据见表1。

图3 决明子总蒽醌提取物对5-Fu致小鼠肝损伤血清ALT（A）和AST（B）水平的影响Fig. 3 Effects of total anthraquinone extract from Cassia seeds on serum ALT(A)and AST(B)levels in 5-FU-induced liver injury mice.**P<0.01 vs normal group;#P<0.05,##P<0.01 vs model group.ALT:Alanine aminotransferase;AST:Aspartate aminotransferase.

2.2.2 决明子总蒽醌提取物对5-Fu模型小鼠肝组织中MPO、T-AOC 和SOD的影响 相比与正常组，模型组MPO含量显著升高（P<0.01），SOD与T-AOC活性显著降低（P<0.01），而决明子总蒽醌提取物与联苯双酯组均不同程度的降低了5-Fu 小鼠肝脏中MPO 的含量（P<0.05），阻断了SOD与T-AOC活性的降低（P<0.01），且决明子总蒽醌提取物低、中、高组呈剂量依赖关系降低或升高抗氧化指标（图4）。决明子总蒽醌提取物低、中、高剂量组详细数据见表1。

图4 决明子总蒽醌提取物对5-Fu致小鼠肝损伤肝组织中MPO(A)、T-AOC(B)和SOD(C)的影响Fig. 4 Effects of total anthraquinone extract from Cassia seeds on MPO(A),T-AOC(B)and SOD(C)in the liver tissue of 5-FU model mice.**P<0.01 vs normal group;#P<0.05,##P<0.01 vs model group

2.3 决明子总蒽醌提取物抗5-Fu致小鼠肝损伤作用的谱效关系及药效成分群的确认

2.3.1 关联度 根据决明子总蒽醌提取物的10批指纹图谱峰面积数据及其抗5-Fu致小鼠肝损伤作用的药效学数据，基于谱效关系中的灰色关联分析原理，利用Matlab 2014a 语言自编谱效灰色关联程序来计算决明子总蒽醌提取物的指纹图谱与抗5-Fu致小鼠肝损伤作用的关联度［17］（图5）。

图5 决明子总蒽醌提取物指纹图谱31个共有峰与抗5-Fu致小鼠肝损伤药效学的关联度Fig. 5 Correlation strengths of 31 common peaks in the fingerprints of the total anthraquinone extract of Cassia seeds with the pharmacodynamics against 5-Fuinduced liver injury in mice.A:ALT;B:AST;C:MPO;D:SOD;E:T-AOC.

2.3.2 关联序 根据决明子总蒽醌提取物指纹图谱31个共有峰与其抗5-Fu致小鼠肝损伤作用的药效学结果之间的关联度大小，对31个共有峰进行排序，得到决明子总蒽醌提取物抗5-Fu致小鼠肝损伤作用的关联序，由关联度从大到小排列（表2）。由表2可知，在不同给药剂量下，不同药效学指标间关联序变化不大，各成分对发挥抗5-Fu致小鼠肝损伤作用的贡献度并不相同。

表2 决明子总蒽醌提取物谱效关系的关联序（前15位）Tab.2 Relational order of the spectrum-effective relationship of the total anthraquinone extract from Cassia seeds(Top 15)

2.3.3 药效成分群的筛选 关联序以及各个成分在不同药效学指标、给药剂量下的出现频率可反应各个成分对发挥药效的贡献度［17］。筛选关联序前15的色谱峰号作为决明子总蒽醌提取物发挥抗5-Fu致小鼠肝损伤的药效成分群，其中已知成分分别为橙黄决明素（按决明子总蒽醌提取物HPLC指纹图谱峰号依次排列，第6号峰，其它同）、大黄酸（第11号峰）、大黄素（第22号峰）、大黄酚（第29号峰）及大黄素甲醚（第30号峰）。

3 讨论

肝脏是人体代谢的主要器官，许多因素都会造成肝脏的损伤，如药物、细菌、病毒等，因此肝脏损伤的病因与发展较为复杂多变，需要准确可靠的生物学指标辅助预防、诊断与治疗。ALT与AST是临床应用最广泛的用于判断肝损伤是否发生的生化指标，在肝脏受到损伤时，细胞膜的通透性发生改变，ALT含量升高，进一步引起线粒体损伤出现AST的升高［18］。5-Fu诱导的模型组小鼠血清中ALT与AST含量明显升高，表明利用5-Fu成功建立了小鼠肝损伤模型。决明子总蒽醌提取物给药组均能不同程度的降低小鼠血清中ALT与AST的含量，且呈剂量依赖关系。

研究发现［19］，氧化应激与肝炎、肝癌、肝纤维化及药物性肝损伤等多种肝病模型密切相关。ROS在肝脏受到损伤时会大量产生，同时机体清除自由基的能力下降，自由基的代谢主要有SOD、GSH-Px、过氧化氢酶（CAT）等进行调控，导致机体内氧化与抗氧化的平衡遭到破坏，形成氧化应激［20］。MPO催化反应可以产生超出局部抗氧化剂抵御范围内的氧化剂，从而导致氧化应激与氧化性组织损伤，而MPO参与炎症反应时，其活性的增加也代表着中性粒细胞介导的炎症反应增多，会产生氧化反应，造成炎症部位的损伤［21,22］。SOD作为体内最主要的抗氧化酶之一，具有清除氧自由基的作用，可以抑制氧化应激从而达到保护肝脏的作用，也可反映机体的抗氧化能力［23,24］。T-AOC是机体总抗氧化能力的评价指标［25］。本实验中，5-Fu诱导的模型组小鼠肝脏匀浆中MPO活性升高，SOD及T-AOC活性下降，给药决明子总蒽醌提取物后，呈剂量依赖性降低肝脏匀浆中MPO活性，升高SOD及T-AOC活性，说明决明子总蒽醌提取物可能通过抑制自由基的生成来抵御氧化应激从而达到保护肝脏的作用。

中药的治疗效果是由中药所含的物质群共同作用产生的，从中发现有效的活性成分并予以确认是中药深入研究的关键。邓氏关联度是最典型的关联度计算模型，常将其用于谱效关系的分析，如抗氧化药效成分群的分析、抗凝血作用的药效成分分析等［26,27］。研究发现［28］，从关联序来看，决明子总蒽醌提取物对5-Fu致小鼠肝损伤的药效学指标ALT、AST、MPO、SOD、T-AOC作用的物质基础基本一致，对各个药效学指标的贡献度也基本相符，前15位化学成分中已知成分为橙黄决明素（按决明子总蒽醌提取物HPLC指纹图谱峰号依次排列，第6号峰，其它同）、大黄酸（第11号峰）、大黄素（第22号峰）、大黄酚（第29号峰）及大黄素甲醚（第30号峰）；从关联度来看，出现低剂量组关联度高于中或高剂量组的现象，与给药剂量的浓度分布不一致。在体外如中药抗氧化药效成分群的分析中，关联度的变化与溶液浓度的低、中、高分布一致，但在动物实验的药效中却出现关联度变化与给药剂量低、中、高剂量的分布不同的现象，尽管这种异常情况并不影响谱效关系的分析与确认。动物实验中影响因素较多，如动物的个体差异较大等，会导致同组数据波动较大，如低剂量组个别数据可能会出现超出中或高剂量组的数据范围，而根据灰色关联原理计算公式中对谱-效数据进行差值处理后，取最大值进行关联度的计算，这会导致在谱效关联中出现关联度与给药剂量低、中、高浓度的分布规律不一致的情况发生。课题组后期将进行谱效关系研究中灰色关联原理的修订与验证。

谱效关系研究结果表明，决明子总蒽醌提取物各成分相互协调发挥抗5-Fu致小鼠肝损伤的保护作用，其中橙黄决明素（按决明子总蒽醌提取物HPLC指纹图谱峰号依次排列，第6号峰，其它同）、大黄酸（第11号峰）、大黄素（第22号峰）、大黄酚（第29号峰）及大黄素甲醚（第30号峰）是决明子总蒽醌提取物中发挥抗5-Fu致小鼠肝损伤的主要药效成分群。