TPGS 修饰的载胰岛素脂质体眼用制剂的制备及其在兔眼的离体角膜渗透与药代动力学

张 丹，杜之渝

重庆医科大学附属第二医院1眼科，2超声分子影像重庆市重点实验室，重庆400010

角膜是屈光系统的重要组成部分，对于正常的视觉形成起着重要作用［1］。严重的角膜疾病会极大的损害视力健康甚至致盲，目前针对难治性角膜疾病治疗较多选用传统滴眼液对角膜进行抗炎、抗感染、促修复等处理。传统滴眼液作为目前治疗患者角膜疾病的首选剂型，由于眼部解剖学、生理学的限制，使得其在眼部生物利用度较低（<5%），治疗效果不佳，给眼部疾病治疗带来了巨大困难［2,3］，且频繁使用皮质类固醇滴眼液进行抗炎时，还可能造成眼压升高并产生角膜毒性［4,5］，因此寻求一种安全、有效、减少用药频率及副作用的眼部新型制剂具有重要意义。

胰岛素（INS）是重要的代谢调节激素，研究证明胰岛素还是潜在的抗氧化剂具有抗炎、抗凋亡、促进神经修复的重要生物学作用［6-8］。相关研究已证明局部应用胰岛素于角膜可加快损伤角膜上皮的愈合、刺激培养的神经元再生及神经元的突触分化和成熟［9,10］。但由于其稳定性差、分子量大，不易通过眼部屏障等性质，该药目前在眼科应用受限［11］。脂质体作为一种新型纳米眼部药物载体它生物相容性好、穿透性强、角膜渗透性好，其特有属性在运载药物治疗眼部疾病时与传统眼药制剂相比具有很大的优势［12-14］。TPGS安全无毒、具有两亲性结构，由维生素E琥珀酸酯（VES）与聚乙二醇（PEG）1000 通过酯化反应制得，它可以作为渗透促进剂、乳化剂修饰脂质体，增加药物在组织的渗透性、增强载药系统的稳定性［15,16］，但在修饰胰岛素脂质体眼用制剂方面的研究尚无报道。在本研究中我们选用胰岛素作为目标药物，采用TPGS作为表面活性剂，制备出TPGS修饰的胰岛素脂质体（T-LPs/INS），考察相关的表征、角膜渗透性能，观察在局部兔眼组织的浓度变化，进行眼部药代动力学特征分析，评价其眼部相对生物利用度，为胰岛素临床治疗角膜疾病的应用提供初步理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

酶标仪（Bio-Rad）、荧光倒置显微镜（Olympus）、3000SSA 型激光粒径电位分析仪（Malvern Instruments）、紫外分光光度计（Shimadzu）、旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）、声震仪（Sonics）、低温高速离心机（Sigma）、人胰岛素（Sigma）、大豆软磷脂（纯度>99%，上海麦克林生化科技有限公司）、胆固醇（上海艾伟拓医药科技有限公司）、TPGS（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）、酶联免疫吸附试验试剂盒（泉州睿信科技有限公司）、磷酸盐缓冲液（武汉赛维尔生物公司）、尼罗红（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）、DMED/F12培养液（Gibco）、胎牛血清（Gibco）、1%青霉素/链霉素（Gibco）。

1.2 脂质体制备及表征

1.2.1 脂质体制备 采用逆向蒸发法［17,18］制备脂质体，按一定比例称量一份大豆软磷脂、胆固醇，溶于加入一定量TPGS的7 mL乙醚，待固体完全溶解后加入溶于PBS的处方量的胰岛素原料药，在室温及一定功率下进行超声30 min，得到水包油（W/O）型乳剂，接着置于旋转蒸发仪上进行减压蒸发2 h，待有机溶剂完全蒸发后即得到胰岛素脂质体混悬液初液，将其移至离心管并在60 w功率、超5 s/空s，冰浴条件下进行声震5 min得到淡蓝色澄清透明的T-LPs/INS。

1.2.2 标准曲线建立与包封率测定 精密称量胰岛素标准品至5 mL容量瓶中稀释至刻度，摇匀得10 mg/mL的胰岛素标准液M0。分别从M0中移取0.125、0.250、0.375、0.500 mL于5 mL容量瓶中，定容至刻度，摇晃均匀后，测其吸光度A214nm，用胰岛素浓度（C）对其A214nm进行回归得出回归方程即得到胰岛素的标准曲线。采用破乳法对T-LPs/INS包封率、载药率进行计算，公式如下：包封率=W1/W2 100%（W1为包封中药物的质量，W2 为体系中药物的投入量）；载药率=W1/W3 100%（W1为包封中药物的质量，W3为体系中脂质体的总量）。

1.2.3 粒径和zeta大小测定 使用激光粒径电位分析仪测定脂质体的粒径与zeta电位。测定样品前对脂质体样品溶液进行稀释，每个样品测定3次。

1.2.4 生物透射电镜测定 采用生物透射电镜对脂质体形态进行分析。将脂质体样品置于铜网进行负染处理，待干燥后进行上机观察拍摄。

1.3 细胞实验

1.3.1 细胞培养 将人角膜上皮细胞（HCECs）培养在配有10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素的DMEM/F12培养基中，并置于37 ℃且含有5%CO2空气的加湿培养箱中培养。指数期生长的细胞用于体外细胞毒性实验。

1.3.2 体外细胞毒性 将HCECs铺于96孔板过夜孵育24 h，加入稀释的待测药物，每组设置6个复孔。孵育24小时后弃去孔内液体，接着每孔加入预配置好的110 μL培养基（CCK8∶培养基=1∶10），置于孵箱30 min，用酶标仪测定在吸光度A450nm，并按照以下公式计算细胞活力（%）：[（A450nm实验-A450nm空白）]/[（A450nm对照-A450nm空白）]100%。

将HCECs接种于12孔板，分别加入无血清稀释的脂质体空球（T-lip，2000 μg/mL）、胰岛素溶液（200 μg/mL），T-LPs/INS（200 μg/mL）共孵育24 h 后，用PBS 冲洗3次，在各孔加入预先配置好的Ca-AM/PI双染色试剂并孵育20 min后，荧光显微镜下观察各组细胞的存活/死亡情况。

1.4 荧光示踪兔眼表滞留研究

采用随机数字表法将实验兔分为2组，每组3只兔6眼。对照组：以预先配置的荧光素钠稀释液50 μL滴眼，连续3次间隔5 min/次；实验组：以荧光素钠标记的T-LPs/INS 50 μL滴眼，连续3次滴眼间隔5 min/次。各组以最后1次滴眼的时间点开始计时，选取适合的时间节点在钴蓝光下拍照记录实验组和对照组兔眼表荧光的消除情况。

1.5 兔角膜渗透研究

以随机数字表法将实验兔分组2组，每组3只兔6眼。对照组：尼罗红稀释液50 μL滴眼，连续3次每次间隔5 min；实验组：尼罗红标记的T-LPs/INS 50 μL滴眼，连续3次每次间隔5 min。各组滴眼后在45 min后用生理盐水冲洗结膜囊，取下眼角膜进行染色、切片，倒置荧光显微镜下观察对比实验组与对照组切片，评估药物在角膜组织各层的渗透性。

1.6 局部眼药代动力学

1.6.1 实验兔分组 健康并排除眼部疾患的新西兰兔（重庆医科大学实验动物中心提供，实验动物使用许可证号SYXK2022-0016，动物伦理审批号为2022年科伦审第179号）48 只，雌雄随机，体质量2.5～3 kg。采用随机数字表法分为实验组、对照组，每组24 只兔48 眼，其中每组设置8 个时间点，每个时间点3 只兔6 只眼。

1.6.2 给药以及眼部样品采集处理、酶联免疫吸附实验检测 用微量加样器向对照组兔眼注入50 μL预先配置的胰岛素滴眼液、实验组兔眼注入50 μL T-LPs/INS，使其轻轻闭合双睑眨眼数次后，任其自由活动。分别于滴眼后的0.1、0.25、0.75、1、2、2.5、4.5、6 h于耳缘静脉处注射过量5%戊巴比妥钠处死，生理盐水充分冲洗眼球，采用微量注射器于角巩膜缘处进针迅速取出房水，采用已消毒好的眼科器械迅速摘除眼球，分离角膜、晶状体、玻璃体等组织，在滤纸吸干后精密称量，所有样品处理后于-80 ℃冰箱冷冻保存。

人胰岛素酶联免疫吸附实验试剂盒置于室温复温1 h，严格按照试剂盒说明书操作进行组织药物浓度检测。采用酶标仪在450 nm波长处测定各孔的A450nm，绘制出标准品的标准曲线并根据曲线方程计算各组样品中胰岛素药品的浓度。

1.7 统计学方法分析

数据采用Graphpad prism 8进行统计分析，计量资料采用均数±标准差表示。应用DAS2软件拟合分析各组兔眼不同部位中胰岛素的达峰时间（Tmax）、最大药物浓度（Cmax）、及药物浓度-时间曲线下面积（AUC0-t）、平均驻留时间（MRT0-t）、药物半衰期（T½）等药代动力学参数。两组间数据差异分析采用独立样本t检验，多组间差异分析采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脂质体纳米粒表征

用胰岛素浓度对其A214nm进行回归得出回归方程（图1A）即得到胰岛素的标准曲线Y=0.0154X+0.0932，R²=0.9997，结果表明胰岛素在25～100 μg/mL之间线性关系良好。脂质体纳米粒粒径为107.0±2.951 nm，Zeta电位为（-6.93±0.505）mV。生物透射电镜（图1C）可以看到，包覆胰岛素的脂质体成圆球状，表面平伏光滑，质地均匀，颗粒间无明显粘连。

图1 胰岛素浓度吸光度曲线及T-LPs/INS的表征检测结果Fig. 1 Characterization of the prepared T-LPs/INS particles.A:A calibration curve of insulin for quantitation of its loading efficiency(absorbance at 214 nm).B:Size distribution of T-LPs/INS.C:TEM of T-LPs/INS.D:Zeta potential of T-LPs/INS.

2.2 脂质体体外细胞毒性

CCK8结果表明（图2），在一定浓度下，不同浓度的游离的脂质体胰岛素（T-lip）对细胞活力的影响没有明显差异（P>0.05）；胰岛素在200 μg/mL浓度范围内，细存活率与对照组无明显差异，当胰岛素浓度继续增大后细胞活力明显下降与对照组对比有较大差异（P<0.001）；在一定浓度范围内T-LPs/INS对于细胞存活率与对照组无明显差异，超过这个范围后，细胞活力下降显著，与对照组相比差异有统计学意义（P<0.001）。活/死染色图像中（图3），绿色荧光细胞表示活细胞，其大量存在也表明胰岛素无论是游离在溶液中还是载于脂质体中对HCECs来说都是安全的。

图2 HCECs与不同浓度游离的脂质体（T-lip）、INS、T-LPs/INS共孵育24 h后的细胞活力Fig. 2 Viability of HCECs treated with free T-lip,insulin solution and T-LPs/INS at different concentrations for 24 h(***P<0.001).

图3 脂质体（T-lip，2000 μg/mL）、胰岛素溶液（200 μg/mL），T-LPs/INS（200 μg/mL）与HCECs共孵育24 h后细胞的活/死染色图像Fig. 3 Live/dead staining of HCECs treated for 24 h with T-lip(2000 μg/mL),insulin solution(200 μg/mL),T-LPs/INS(200 μg/mL)(Ca-AM/PI staining,original magnification:×100).

2.3 局部兔眼荧光滞留示踪

如图4A为给药后不同时间段内手持裂隙灯显微镜在钴蓝光下眼部荧光滞留的情况。在给新西兰兔点眼后，随着兔子泪液的更新及眨眼，药物会被迅速消除，部分滴眼液会随着眼角流出，在对照组中可以观察到10 min左右检测到微量荧光，实验组在给药后30～40 min 仍然可检测到荧光。可以直观的看出T-LPs/INS滴眼液在眼部滞留能力强于INS滴眼液。

图4 各组在兔眼眼表滞留性的荧光示踪图像及分析Fig. 4 Fluorescent tracer images showing ocular surface retention of insulin in rabbit eyes (A,fluorescein sodium staining,×1)and fluorescence area analysis curves(B)in each group.

2.4 兔角膜渗透性示踪

尼罗红标记的T-LPs/INS与尼罗红稀释液分别滴入兔眼结膜囊不同时间后进行处理做成角膜冰冻切后皆在荧光显微镜下观察到荧光显色，图5A为滴眼后45 min，对照组与实验组角膜荧光积累量的示踪对比。开始主要集中在角膜上皮层面，随着时间的推移，TLPs/INS开始逐渐向角膜基质层渗透并不断累积，而对照组则停留在浅层角膜上皮组织。

图5 各组在兔眼角膜的冰冻切片图像及分析Fig. 5 Frozen section images of the cornea(A,Nile red and DAPI staining,×200) and fluorescence penetration area (B) in each group(****P<0.0001 vs INS).

2.5 局部兔眼药代动力学

滴眼后，实验组兔眼角膜中INS药物浓度于1 h达到峰值，之后随时间的推移呈逐步下降的趋势，对照组兔眼中角膜INS 药物浓度则随着时间推移呈现逐步下降的趋势（图6）。点药后0.1、0.25、0.75、1、2 h两组兔眼角膜组织INS浓度相比较，差异均有统计学意义（P<0.01）；在点眼后2.5、4.5、6 h对照组兔眼角膜中的INS浓度低至无法检测。

图6 滴眼后不同时间各组兔眼角膜中胰岛素浓度变化Fig. 6 Changes in insulin concentration in the cornea in each group at different times after eye dropping (Data are shown as Mean±SD,n=3).

通过药代动力学软件分析，各组药代动力学参数如表1所示。实验组单次点眼后角膜药代动力学参数Tmax为1 h，Cmax为52.137 mIU/g，实验组的T½为1.306 h约为对照组T½的2倍、AUC0-t是138.189 mIU/g*h约为对照组的13倍、MRT0-t为2.117 h约为对照组的3倍，药代动力学参数拟合分析发现实验组角膜INS浓度变化符合二室模型，对照组则符合一室模型。

表1 各组兔眼角膜中胰岛素药代动力学参数Tab.1 Pharmacokinetic parameters of insulin in rabbit cornea in T-LPs/INS and insulin groups

滴眼后，实验组与对照组兔眼房水中INS药物浓度均在0.75 h达到峰值，之后随着时间的推移，兔眼房水中的INS药物浓度呈现逐渐下降的趋势（图7）。点药后0.1 h两组兔眼房水组织INS浓度相比较，差异无统计学意义（P>0.05），点眼后0.25、0.75、1、2 h两组兔眼房水INS浓度相比较，差异均有统计学意义（P<0.01）；在点眼后2.5、4.5、6 h 对照组兔眼房水中的INS 浓度低至无法检测。

图7 滴眼后不同时间各组兔眼房水中胰岛素浓度变化Fig. 7 Changes in insulin concentration in the aqueous humor of rabbits in each group at different times after eye dropping(Mean±SD,n=3).

通过药代动力学软件分析，各组药代动力学参数如下表2。实验组与对照组单次点眼后兔眼房水Cmax分别为12.160 mIU/mL、2.454 mIU/mL，可以看出实验组比对照组提高了4倍；实验组兔眼房水的药物T½为1.746 h，与对照组为相比提高了2倍；实验组与对照组兔眼房水的AUC0-t分别为27.491 mIU/mL*h、2.883 mIU/mL*h，与对照组相比实验组的AUC0-t约提高了9倍；实验组房水的MRT0-t为2.062 h约是对照组的2倍。通过药代动力学参数拟合分析得出实验组兔眼房水INS浓度变化符合二室模型，对照组则符合一室模型。

表2 各组兔眼房水中胰岛素药代动力学参数Tab.2 Pharmacokinetic parameters of insulin in rabbit aqueous humor of various groups

3 讨论

本研究以逆向蒸发法制备出TPGS修饰的载胰岛素脂质体，并考察了T-LPs/INS的表征、体外安全性及在兔眼角膜的渗透性及局部药代动力学。从表征的结果来看，其粒径适中性质稳定，微观形态呈均匀分布的圆形，与Peng等［19,20］结果一致。安全性对新型眼部制剂的潜在应用至关重要，脂质体作为近年来新兴的药物载体，相关研究表明脂质体包被药物之后降低药物对眼部组织的刺激，可减轻眼部各组织的毒副作用［21-23］，而在本研究中我们也通过多项实验初步评估验证了T-LPs/INS的安全性，活/死细胞实验中显示经过药物共孵育后，HCECs仍然大量存活并且活力良好。细胞毒性实验研究中我们发现T-LPs/INS的安全浓度可达到200 μg/mL（约对应于6 IU/mL），而Cruz-Cazarim［24］研究中胰岛素治疗干眼综合征模型下角膜损伤的有效浓度为35 μg/mL（对应于1 IU/mL），因此我们认为本实验制备的T-LPs/INS是相对安全的，可适用于局部滴眼实验。

载药系统给药能到达特定细胞累积被其有效摄取利用才能起到作用。药物通过被动扩散、主动扩散等方式渗透角膜，而角膜由5层结构组成：上皮层、前弹力层、基质层、后弹力层、内皮层，呈现特有的脂溶性-水溶性-脂溶性夹心结构，药物渗透角膜过程中，角膜上皮的紧密连接是影响药物吸收的重要屏障［25,26］。我们可以直观的观察到T-LPs/INS滴眼液渗透进入角膜深层的药物浓度相对更高，具有良好的促进药物在角膜渗透吸收的作用，这也将保证药物能够到达角膜各层并被角膜细胞有效摄取发挥作用。药物眼表滞留研究中，由于TLPs/INS具有缓释性能，相较于单纯的胰岛素滴眼液其在眼表滞留特性更好，这将会使得T-LPs/INS能较好的克服传统局部滴眼液由于快速流失、利用率低导致的缺陷并降低频繁滴眼所带来的副作用。在眼部药动学研究中，药代动力学分析结果显示，T-LPs/INS滴眼液与胰岛素滴眼液对兔眼进行点眼后测量不同时间点的角膜、房水中胰岛素药物的浓度，几乎都是使用T-LPs/INS滴眼的组中相对更高。对数据进行药代学拟合分析，实验组与对照组兔在单次点眼后角膜的T½分别为1.306 h、0.661 h，房水的T½分别为1.746 h、0.537 h，实验组角膜的T½约为对照组的2倍、房水的T½约为对照组的3倍，说明脂质体纳米载药系统可以延长药物半衰期［27］，可通过减少用药频率进而减少药物不良反应及提高患者顺应性；两组兔在单次点眼后角膜的AUC0-t分别为138.189 mIU/g*h、10.637 mIU/g*h，房水的AUC0-t分别为27.491 mIU/mL*h、2.883 mIU/L*h，与对照组相比，实验组角膜的AUC0-t增加了12倍、房水的AUC0-t增加了9倍，这说明T-LPs/INS促进了药物在眼部吸收与滞留，呈现出明显的缓释作用与长效性［28］。在给药时由于眼局部结构的多重屏障［29,30］单纯的胰岛素滴眼液局部点眼后的药物的角膜渗透性较差，在角膜累积量也甚微，在眼部应用生物利用率极低，这也很难达到有效的治愈角膜疾病的效果，而我们的研究中实验组角膜与房水的药物浓度与对照组相对比有显著提高，这也说明TLPs/INS减少了药物流失、提高了在角膜中药物浓度的维持时间，使得药物在角膜组织的累计相对提高。角膜与房水药物浓度对比明显累积量较大，这表明T-LPs/INS延缓药物进入房水，也说明药物从脂质体中缓释主要通过作用于角膜吸收而发挥治疗效果，这提示TPGS修饰的胰岛素脂质体滴眼液对基本角膜损伤甚至角膜深层结构抗炎、抗凋亡等的作用可能达到相对理想的效果，这也与Alkholief等［31,32］结果一致。药代动力学参数拟合分析得出实验组兔眼角膜、房水INS浓度变化符合二室模型，对照组则符合一室模型，单纯药物进入组织时很快分布并达到平衡，而以修饰的脂质体包裹药物后进入组织，我们推测脂质体包裹药物后由于对药物的缓释作用，使得药物转运分布的速率不一致，同时使药物代谢动力学参数也出现明显改变。

综上所述T-LPs/INS相对单纯胰岛素滴眼液有效性会更好。同时由于其生物利用度提高，可以减少给药频率，更有利于增加患者依从性，这为进一步使用胰岛素治疗角膜疾病的应用及临床研究提供初步理论基础，但本实验研究仍存在局限性，检测不同时间点的兔眼虹膜、晶体等眼部组织中药物浓度时，由于药物浓度极低，未能完全检测出；并未设计检测血液样品药物浓度，尽管由于血-眼屏障的存在，通过局部给药进入全身循环的量甚微，今后应注意完善实验检测方法及数据分析。