严重型脊髓性肌萎缩症小鼠肝脏代谢紊乱的分子病理机制

刘力赫，朱明芮，王一凡，万 波，姜 智

苏州大学苏州医学院，江苏 苏州215000

脊髓性肌萎缩症（SMA）是儿童常见的常染色体隐性遗传病，是2岁以下婴幼儿致死性遗传病的首位病因［1,2］。SMA患者由于运动神经元存活蛋白（SMN）1基因发生突变或丢失，仅依赖SMN2所表达的少量全长SMN蛋白。SMN的缺乏会导致脊髓前角α-运动神经元死亡，进一步引发其支配的肌肉进行性萎缩，最终因呼吸衰竭而夭亡或终身瘫痪［3］。SMN在多种组织中广泛表达，在RNA加工过程中发挥作用，包括mRNA的运输和snRNP复合物的组装等功能［4-6］。

研究发现SMA病变不局限于神经系统，在SMA患者和小鼠模型的肝脏、小肠、胰腺、脾脏等外周组织中均存在异常［7-9］。肝脏特异性敲除SMN1的小鼠胚胎致死；严重型SMA小鼠和患者在发病过程中会出现代谢紊乱。本研究团队前期研究也发现I型SMA小鼠的天冬氨酸转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）和白蛋白（ALB）3个肝功能指标异常，外周血中的葡萄糖、血清铁、甘油三酯（TG）、总酮体（TBK）、游离脂肪酸（NEFA）含量明显低于同窝健康对照小鼠［10］；肝脏不仅是机体最大的消化与代谢器官，而且是重要的免疫器官。SMA小鼠肝脏代谢功能紊乱的分子机制是什么？SMA小鼠肝脏代谢功能紊乱是否影响SMA病程的进展？面对以上问题，目前尚未有系统性的深入研究和阐述。因此，本研究首先探索腹腔注射葡萄糖溶液对I型SMA小鼠寿命的影响；为寻找I型SMA小鼠的肝脏代谢紊乱的分子病理机制，对I型SMA小鼠肝脏组织RNA测序数据进行再分析，筛选、验证相关信号通路的变化；分析基因表达发生显著变化的原因，进一步加深对SMA发病机制的认识。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 I型SMA小鼠（Smn-/-SMN20tg/2tg）和对照小鼠（Smn+/-SMN20tg/2tg）（Jackson实验室，美国冷泉港实验室赠送）；所用小鼠饲养于苏州大学实验动物中心SPF动物房。本研究所涉及的实验和操作均通过苏州大学动物伦理委员会审查，严格按照《实验动物管理条例》进行实验操作。

1.1.2 实验试剂 逆转录酶（M-MLV）试剂盒（南京诺唯赞生物科技公司）。PPAR激动剂WY-14643（MCE），DNA 甲基转移酶抑制剂5-AzaC（MCE），胶原酶（Roche），透明质酸酶（Sigma-Aldrich），脱氧核糖核酸酶I（Sigma-Aldrich），Percoll 细胞分离液(上海优宁维)，Fasn 多克隆抗体（Proteintech），SMN 单克隆抗体（BD Bioscience）。

1.2 方法

1.2.1 生物信息分析 下载I型SMA小鼠P5肝脏组织RNA 测序数 据，利 用Gene Ontology（http://geneontology.org/）对差异表达基因进行GO terms富集度统计学分析，计算出差异基因GO term的P-value，定位差异基因最可能相关的分子功能或信号通路。运用TRANSFAC 数据库（http://genexplain.com/transfac/）的预测转录因子结合位点的MATCH工具分析显著变化基因启动子区域潜在的转录因子结合位点。

1.2.2 细胞/组织总RNA的提取（TRIZOL法）及逆转录合成cDNA 50～100 mg细胞/组织加入1 mL TRIZOL，随后加入200 μL氯仿摇晃混匀，室温静置10 min。在4 ℃下以12 000 r/min的转速冷冻离心15 min。RNA分布在上层的水相中，用异丙醇沉淀水相中的RNA，并用70%乙醇洗涤沉淀，得到纯净的总RNA。取1 μg总RNA，进一步采用逆转录酶（M-MLV）试剂盒逆转录合成cDNA。

1.2.3 实时定量PCR 实时定量PCR 在Applied Biosystems7500 Real Time PCR system（CA）上进行，定量所用试剂为2×SYBR Green real-time PCR master mix（TOYOBO）。每个反应的特异性可用溶解曲线反映。每个反应重复3次，使用2-ΔΔCt方法定量。实时定量PCR方法步骤：95 ℃预变性5 min，其次是45个循环的95 ℃退火15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，延伸结束后在85 ℃检测信号。每个反应重复3次，使用2-ΔΔCt方法定量，内参为Gapdh。

1.2.4 肝细胞分离 小鼠冷冻麻醉后，取肝脏至培养皿剪碎，在含1 mg/mL 胶原酶、2 mg/mL 透明质酸酶、20 μg/mL脱氧核糖核酸酶I的RPMI 1640培养基37 ℃孵育、消化45 min 70 μm滤网过滤后离心分离，将细胞沉淀重悬于红细胞裂解液，离心获得单细胞混合体。

肝细胞（HC）的细胞密度比肝脏非实质细胞（NPCs）大，采用低速离心（4 ℃，50×g，2～4 min）分离HC 和NPCs。经过离心后，HC沉降至管底，NPCs 处于细胞悬液中。移弃上层液体，将沉淀的HC 细胞用10 mL 的RPMI 1640 培养基重悬于50 mL 离心管中，再移取10 mL Percoll细胞分离液至HC细胞悬液中，上下颠倒离心管，混匀细胞。采用低速离心（4 ℃，200×g，10 min），离心后活的HC细胞沉淀于管底，死的或者破碎的HC悬浮于液体中。移弃细胞悬液，用细胞培养液重悬管底的HC，再次低速离心（4 ℃，50×g，2～4 min），获得高纯度的HC细胞，计数接种于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液继续开展后续实验。

1.2.5 亚硫酸盐测序法定量分析Fasn启动子区CpG岛甲基化水平 实验方法参照文献［11］。经亚硫酸盐处理后PCR 扩增Fasn 基因启动子区的引物F: 5'-TGTATTGAGGAGGATATTAGGGTTA-3'，R:5'-AAA TAACCACAAAAAATAAAAATCC-3'。使用在线软件QUMA（http://quma.cdb.riken.jp/）定量分析甲基化情况。

1.3 统计学分析

实验数据采用Graphpad prism 5软件进行统计分析，计量数据用均数±标准差表示，两组间比较，符合正态分布的采用独立样本的t检验；两组生存曲线之间的比较，采用Kaplan-Meier生存分析。P<0.05为差异具有统计学意义。所有的实验都是独立重复3次或3次以上。

2 结果

2.1 I型SMA小鼠体质量降低

观察I型SMA和同窝正常对照小鼠在出生后连续7 d的外型和体质量变化，结果显示，I型SMA和对照小鼠胃内都充满白色奶汁，但I型SMA小鼠体形明显小于对照小鼠（图1A）；P2的I型SMA小鼠还处于症状前期，其体质量开始轻于同窝健康对照小鼠（n≥14，P<0.001），SMA小鼠表现出明显的消耗性疾病的症状（图1B）。

图1 SMA和对照小鼠喝奶及体质量变化情况Fig. 1 Milk suckling and body weight of type I SMA and control mice.A:Type I SMA mice have a lower body weight.P4 type I SMA and control littermates mice are filled with white milk,but the body shape of type I SMA mice are smaller.B:Body weight of type I SMA and control mice from 0 to 6 days of age(Mean±SD,n≥14,**P<0.001).

2.2 腹腔注射葡萄糖溶液能延长I型SMA小鼠生存时间

在I型SMA小鼠出生后，每隔12 h给小鼠腹腔注射15 μL 20%浓度的葡萄糖溶液，I型SMA小鼠生存时间由9±1.3 d延长至11±1.5 d（P<0.05，图2A），但其体形和体质量仍明显小于同窝健康对照小鼠（图2B）。

图2 葡萄糖溶液治疗I型SMA小鼠Fig. 2 Intraperitoneal injection of dextrose(glucose)prolonged the survival of type I SMA mice.A:Kaplan-Meier survival curves of the mice treated with saline or glucose.B:Type I SMA mice injected with 20% glucose solution had smaller body size than the littermate controls mice on the 10th day after birth.P<0.05(log-rank test).

2.3 I型SMA小鼠发病过程中肝脏内PPARα 正调控的代谢相关基因下调表达

分析P5 的I 型SMA 小鼠肝脏RNA 测序数据发现，共有5372个基因表达失调。对表达失调的基因进行GO terms富集分析，发现与脂代谢、糖代谢等相关基因显著下调表达（图3B）。运用TRANSFAC 数据库中的预测转录因子结合位点的MATCH工具分析发现这些显著下调表达的基因是过氧化物酶体增殖激活受体α（PPARα）靶向调控的基因。

图3 P5 I型小鼠肝脏组织RNA-seq 数据再分析Fig. 3 Reanalysis of RNA-seq data in the liver tissue of P5 type I mice.A: RNA-seq data volcano map of the liver tissue of P5 type I SMA mice.The red dot indicates the genes with significant differential expression between type I and control mice(FDR<10%,P<0.05).B:Enrichment of the differentially expressed genes by GO terms.

为验证上述基因表达变化，本研究利用定量PCR检测了脂代谢相关基因的表达变化情况，结果显示P4的I型SMA小鼠与同窝健康对照小鼠相比较，脂蛋白摄取/代谢（Lipc、Vldlr、Fabp1-5、Fasn）、线粒体β 氧化（Cpt1a、Cpt2、Decr1、Hadha、Hadhb）等代谢通路中的一些代表性基因都显著下调表达（图4A），蛋白免疫印迹实验显示，脂代谢关键酶基因Fasn在I型SMA小鼠肝脏组织中显著下调表达（P<0.01，图4B）。

图4 SMA与对照小鼠肝脏脂代谢、线粒体β氧化相关基因表达情况Fig. 4 Expression of genes related to liver lipid metabolism and mitochondrial β oxidation in SMA mice and control mice.A:Results of RT-qPCR for detecting mRNA levels of the genes related to lipid metabolism and mitochondrial β oxidation in the liver of P4 type I SMA and control mice.Data were normalized to GAPDH and presented as fold changes relative to the controls(n=4,*P<0.05,**P<0.01).B:Representative Western blots(left panel)and quantitative analysis(right panel)of Fasn and SMN expressions in the liver of in type I SMAmice and control mice(n=4,**P<0.01).

2.4 DNA甲基转移酶抑制剂能增加SMA小鼠原代培养肝细胞脂代谢相关基因表达

本研究抽提小鼠肝组织DNA，经重亚硫酸盐测序分析发现，出生后第4天的I型SMA小鼠肝组织中Fasn基因启动子区域甲基化程度（76.44%）高于同窝正常对照小鼠（58.67%）（图5A）。原代培养新生SMA小鼠的肝细胞，在细胞培养基中添加PPAR激动剂WY-14643（终浓度10 μmol/L）或DNA甲基转移酶抑制剂5-AzaC（20 μmol/L）培养36 h后，定量PCR检测发现经5-AzaC刺激后Cpt1a、Acox1、Ehhadh、Fasn等基因的转录表达是空白对照的2倍以上（P<0.001）；WY-14643能上调Cpt1a、Fasn 等部分基因的表达，其作用弱于5-AzaC（图5B）。原代培养新生SMA小鼠的肝细胞经5-AzaC诱导后，细胞内的Fasn蛋白表达显著上调（P<0.001，图5C）。

图5 WY-14643和5-AzaC 对SMA小鼠肝细胞脂代谢相关基因表达的影响Fig. 5 Effects of WY-14643 and 5-AzaC on the expression of genes related to lipid metabolism in primary cultured hepatocytes of SMA mice.A:Methylation of Fasn gene promoter region in the liver tissues of P1 and P4 type I SMA mice and control mice analyzed by bisulfite sequencing.Filled circles are methylated and open circles are unmethylated CpGs.B:Effect of WY-14643(10 μmol/L)and 5-AzaC(20 μmol/L)on mRNA expressions of the genes related to lipid metabolism in primary cultured SMA mouse hepatocytes detected by qPCR.GAPDH was used as the reference gene (n=4,*P<0.05,**P<0.001). C: Representative Western blots of Fasn (left) and quantitative analysis (right) in primary cultured SMA mouse hepatocytes treated with DMSO or 5-AzaC(n=3,**P<0.001).

3 讨论

本研究I型SMA小鼠和对照小鼠喝奶及体质量变化情况实验发现，两组小鼠都能正常喝奶，但对照小鼠体质量保持上升趋势且上升速率逐渐加快；而I型SMA小鼠从P2开始明显体型偏小、体质量偏低，表现出消耗性的状态。这说明SMA小鼠在相同的摄入情况下无法吸收利用营养物质。本研究从P1起持续每隔12 h给I型SMA小鼠腹腔注射葡萄糖溶液，SMA小鼠的平均生存时间延长2 d，其体质量及体型仍明显小于对照小鼠，且其生存时间仍短于正常小鼠。进一步说明葡萄糖的利用不足和能量缺乏是SMA小鼠体质量下降且生存时间缩短的重要原因之一，仅依靠葡萄糖供能仍无法满足SMA小鼠发育所需。

为分析SMA小鼠早期出现代谢紊乱的原因，有研究报道I型SMA台湾小鼠模型脊髓、脑、骨骼肌和肝4种组织的转录组分析，显示出P5的I型SMA小鼠肝脏组织中有5372个基因表达失调，远高于其他组织失调表达基因的数目［4］，提示I型SMA小鼠肝脏受到损害相对严重。对表达失调的基因进行信号通路聚类分析，发现肝脏中与脂代谢、糖代谢、细胞生长和增殖相关的基因则显著下调表达。结合转录调控网络分析，发现这些显著变化的基因是PPARα靶向调控的基因［12-14］。

PPAR 是配体激活的转录因子，属于核受体超家族，目前有3个成员：PPARα，PPARγ和PPARδ。其在肝脏、骨骼肌、肾脏、心脏、肠和血管等组织中高丰度表达，广泛参与机体的脂质代谢、糖代谢、线粒体功能、血压调节、细胞生长分化及生殖过程，在维持机体脂质和能量平衡过程中发挥重要作用，并在病理性损伤引起的炎症反应过程中发挥重要的保护作用［15］。有研究表明，PPARα是肝脏脂质代谢的主要调节因子，特别是在禁食期间，PPARα能诱导肝脏脂肪酸氧化和生酮，并调节肝脏葡萄糖的产生［16-18］。除此之外，PPARα能有效诱导多种脂质代谢相关基因的表达，包括微粒体、过氧化物酶体和线粒体脂肪酸氧化，脂肪酸结合和激活、脂肪酸伸长和去饱和、甘油三酯和脂滴的合成和分解、脂蛋白代谢、糖异生、胆汁酸代谢以及各种其他代谢途径和基因［19］。PPARα与维甲酸X受体α（RXRα）等结合成异源二聚体，与靶基因启动子区的特定序列靶元件结合，招募DNA甲基转移酶、组蛋白乙酰化修饰酶或组蛋白甲基化修饰酶等蛋白，引起核小体和染色体重塑，影响RNA聚合酶II转录复合体对PPARα靶基因的转录［20,21］。

胎儿出生前通过脐带血直接从母体获得葡萄糖，作为发育的主要能量［22］。而胎儿期脂肪酸β氧化等代谢途径基因处于DNA甲基化转录失活状态［23-25］。出生后肝脏脂肪酸β氧化被激活，由合成代谢转为分解代谢，从母乳脂质中产生能量［26］。最近研究证实胎儿出生后DNA去甲基化而mRNA表达增加的基因，与代谢功能显著相关。脂肪酸β氧化途径相关基因的DNA甲基化程度具有发育阶段特征性［23］；PPARα是哺乳期肝脏代谢基因DNA去甲基化的关键因子［23］。胎儿出生后PPARα转录调控的脂肪酸β氧化等代谢途径基因：如酰基辅酶a氧化酶1（Acox 1）和烯酰辅酶a，以及水合酶/3-羟基酰基辅酶a脱氢酶（Ehhadh）的甲基化水平显著降低。与此同时，这些基因的mRNA表达和蛋白水平在母乳喂养开始时显著升高，即通过DNA去甲基化等表观遗传学机制活化［11,23-25,27］。肝内糖/脂代谢途径激活，新生儿通过肝内逐渐表达的代谢酶消化乳汁，满足生长发育所需的营养和能量［28,29］。脂肪酸氧化为心脏、肝脏、脑、骨骼肌等器官提供了80%的能量；尤其是在空腹组织糖原耗尽时，脂肪酸β氧化途径产生的酮体，被脊髓和脑中的神经元以及肌肉细胞直接利用［28,29］。如果脂肪酸氧化等代谢酶缺陷，新生儿将出现新陈代谢转换障碍，导致婴幼儿死亡［28,30］。本研究通过实时定量PCR检测发现I型SMA小鼠肝脏脂蛋白摄取/代谢、线粒体β氧化等代谢通路中的一些代表性基因都显著下调表达。通过重亚硫酸盐测序，本研究检测到I型SMA小鼠肝脏组织中Fasn基因启动子区域高度甲基化，I型SMA小鼠原代培养肝细胞中添加DNA甲基转移酶抑制剂5-AzaC能显著增加Fasn 等脂代谢相关基因表达。进一步说明了I 型SMA小鼠的肝脏代谢转换障碍。

综上所述，可以初步得出严重肌萎缩症肝脏代谢紊乱的病理机制：严重型SMA小鼠出生后，由于SMN缺乏，导致PPARα调控的糖脂代谢相关基因持续甲基化而低表达，引发代谢转换障碍，无法满足脑、脊髓和肌肉等组织的发育生长所需的营养和能量，加速SMA病程发展。本研究进一步加深了对SMA病理机制的认识，也为寻找新的SMA治疗方案提供理论基础。