奇异变形杆菌modABC 基因缺失株的构建及其生物学特性

黄 伊，丁 信，黄 楠，陈灿雄，邓小燕

1广州市传染性疾病临床快速诊断与预警重点实验室，广东 广州 510180；2广州医科大学金域检验学院，广东广州510180

奇异变形杆菌（PMI）其在琼脂平板上具备群集迁移运动的特点受研究者的广泛关注。它是一种条件致病菌，能够引起人伤口、眼睛、胃肠道和尿路的感染，是引起导管相关性尿路感染（CAUTI）的主要原因，常并发膀胱和肾结石的形成(尿石症)和永久性的肾脏损害，并可能进展为菌血症和败血症［1-4］。近年来由于抗生素滥用，奇异变形杆菌耐药性呈现逐年上升趋势，临床治疗效果欠佳，且易于形成生物被膜而导致感染迁延不愈，因此奇异变形杆菌所致尿路感染疾病及其致病机制应引起临床的重视［5,6］。

钼是大多数生命体必需的微量元素，由modABC基因编码ModABC蛋白协助细菌以高亲和力转运微量元素钼酸盐，转运至菌体内的钼酸盐以钼辅因子的形式参与钼酶的合成，在细菌的厌氧呼吸中发挥至关重要的作用［7-13］。近年来越来越多的研究显示modABC基因与细菌毒力和致病性存在相关性，表明它们可能是未来重要的药物靶标。研究发现modABC基因增强肺炎克雷伯菌致肌肉感染，铜绿假单胞菌和结核分枝杆菌的modA基因与细菌生物被膜形成及毒力存在正相关性，提示modABC基因与细菌毒力紧密相关［7,8,10,11,14,15］。目前国内外关于modABC基因在奇异变形杆菌生长代谢过程中的具体功能仍然未知，该基因对奇异变形杆菌毒力因子的作用及致病机制仍待研究。因此，了解并深入探寻modABC基因在奇异变形杆菌生长、代谢等过程中执行的功能及其毒力基础和致病机制非常必要。本研究利用自杀载体系统，采用同源重组的方法构建奇异变形杆菌亲本株PMI的modABC基因敲除突变株，初步研究其生物学特性，通过电感耦合等离子质谱法（ICP-MS）测定其胞内钼含量，并检测其生长曲线，为进一步研究modABC基因的生物学功能及奇异变形杆菌致病性提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、质粒 奇异变形杆菌PMI（四环素抗性）菌株由密歇根大学医学院Harry L.T.Mobley教授惠赠。

1.1.2 主要试剂和仪器 本实验室所用的化学试剂为分析纯，购自TaKaRa、阿拉丁、Sangon和Oxoid等公司。ICP-MS所用试剂均为优级纯，水为GB/T 6682规定的一级水。

THZ-82B 气浴恒温摇床（常州金坛精工仪器有限公司），BI-120F恒温培养箱（广东正一实验设备有限公司），micropulser 电转化 仪、T100 梯度PCR 仪（BioRad），台式离心机（Eppendorf），琼脂糖水平电泳仪DYCP-32A（北京六一仪器厂），凝胶紫外成像仪（复日科技公司），0.22 μm 除菌过滤器（millipor）。

1.2 方法

1.2.1modABC基因两侧同源序列及Kn抗性基因的扩增 从NCBI核酸序列数据库获取PMI的基因及其两侧DNA 序列，设计合成两侧序列扩增引物-AF、-AR及-BF、-BR。以PMI 基因组DNA 为模板，分别通过PCR扩增基因上游的A片段和下游的B片段。设计合成Kn抗性基因（卡那霉素抗性基因）扩增引物-KnF和-KnR，利用高保真PCR反应从pET28a质粒上扩增Kn抗性基因序列。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定条带正确后，利用胶回收试剂盒纯化后备用。引物序列详见表1，PCR扩增体系及条件见表2、3。

表1 基因缺失株构建及鉴定的引物Tab.1 Primers used for construction and identification of modABC gene deletion strain

表2 PCR反应体系Tab.2 System of PCR reaction

表3 PCR反应条件Tab.3 Reference conditions of PCR reaction

1.2.2 基因上、下游片段的连接 基因两侧序列与Kn抗性基因通过融合PCR进行连接。将纯化后的上、下游同源臂片段和Kn抗性基因片段等比例混合，以混合DNA片段作为模板进行融合PCR，引物对为-AF/BR。PCR反应体系和扩增条件同上，最后得到连接好的重组片段，纯化PCR产物（图1），融合PCR反应体系及条件见表2、3。

图1 基因缺陷同源性打靶示意图Fig. 1 Schematic diagram of homologous recombination for modABC gene deletion.The gray arrow indicates the ORF region of modABC gene and Kn gene.The light gray regions flanking modABC gene represent the A gene on the target gene and the B gene(downstream).The primer pairs(-AF/R,-BF/R)of Aand B genes on both sides and the primer pairs(-KnF/R)of Kn gene are marked.

1.2.3 同源重组质粒的构建 将质粒pCVD442经SmaI酶切后割胶纯化，30 ℃反应2 h。酶切反应结束后，载体和融合PCR产物分别经1%琼脂糖电泳分离，柱离心纯化，洗脱于50 μL 去离子水。经SmaI 酶切后的pCVD442质粒和融合PCR产物与T4DNA连接酶16 ℃反应过夜，连接产物经异丙醇沉淀后，70%乙醇洗涤，溶解于5 μL去离子水。通过电转化方法将其转入大肠杆菌DH5αλpir，在LB平板（含氨苄青霉素50 μg/mL，卡那霉素25 μg/mL）上于37 ℃培养至单克隆形成。在氨苄青霉素、卡那霉素双抗性平板上生长的克隆含有打靶片段，选择1个克隆测序验证序列正确后进行后续实验，命名为pCVD442-ΔmodABC::Kn。接种此克隆入3 mL LB（含氨苄青霉素50 μg/mL，卡那霉素25 μg/mL），37 ℃培养过夜，次日柱离心法纯化质粒DNA。将打靶载体pCVD442-ΔmodABC::Kn电转化进入大肠杆菌β2155菌株，铺LB平板（含氨苄青霉素100 μg/mL，0.5 mmol/L DAP（二氨基庚二酸，阿拉丁试剂），37 ℃培养至单克隆形成。此克隆即为用于接合实验的供体菌株β2155/pCVD442-ΔmodABC::Kn。

1.2.4 接合实验及modABC基因敲除菌株筛选 在LB平板上划线接种受体菌奇异变形杆菌PMI，37 ℃培养至单克隆形成。挑单克隆入3 mL LB，37 ℃，220 r/min培养过夜，挑β2155/pCVD442-ΔmodABC::Kn单克隆入3 mLLB（含Amp 100 μg/mL，0.5 mmol/LDAP）。37 ℃，220 r/min培养过夜。取500 μL供体菌β2155/pCVD442-ΔmodABC::Kn菌液与500 μL受体菌（奇异变形杆菌）菌液混合进行接合实验。取50 μL接合后菌液涂布于含有氨苄青霉素（100 μg/mL）和卡那霉素（33 μg/mL）的LB平板，30 ℃培养至单克隆形成。在抗性平板上，随机挑选10个克隆，依次用牙签挑入同一管100 μL LB培养基，混合均匀后，取10 μL 接种3 mL LB 培养基，于30 ℃、220 r/min培养过夜。次日，取50 μL培养液铺于含10%蔗糖的LB平板（含Kn33 μg/mL，不含NaCl），置30 ℃培养至单克隆形成。随机挑选14个单克隆，分别接种3 mL LB 培养基（含Kn33 μg/mL），30 ℃培养过夜。次日，取少量菌液用modABC基因内部引物进行PCR鉴定。并用外侧引物进行进一步的鉴定。取内部引物成功鉴定的其中一个克隆的少量菌液，用外侧引物进行PCR反应，PCR反应体系及条件见表2、3。

1.2.5 将PCR扩增产物送测序验证。

1.2.6 ICP-MS检测钼离子浓度 方法参考GB 5009.268-2016［16］，将冻存的亲本株PMI和敲除株△modABC分别以1∶100比例接种到新鲜的LB培养液中。至于恒温摇床中37 ℃振荡培养至稳定期，从中取出1 mL菌液离心，无菌1×PBS清洗两遍，用1 mL无菌1×PBS重悬用接种环取一环细菌四区划线接种至血琼脂平板培养基，37 ℃过夜培养。

轻轻刮取血琼脂平板培养基表面的细菌，称取细菌样品0.2～0.5 g（必要时经高速粉碎机粉碎均匀,精确至0.001 g）于微波消解内罐中，加入5～10 mL硝酸，加盖放置1 h或过夜，旋紧罐盖，按照微波消解仪标准操作步骤进行消解（消解参考条件见表4）。冷却后取出，缓慢打开罐盖排气，用少量水冲洗内盖，将消解罐放在控温电热板上或超声水浴箱中，于100 ℃加热30 min或超声脱气2～5 min，添加水定容至25或50 mL，混匀备用，同时做空白试验。按照电感耦合等离子体质谱仪标准操作步骤进行（操作条件见表5），在调谐仪器达到测定要求后，编辑测定方法，根据待测钼元素的性质选择内标元素103Rh/115In，待测元素和内标元素的m/z为95。将混合标准溶液注入电感耦合等离子体质谱仪中，测定待测元素和内标元素的信号响应值，以待测元素的浓度为横坐标，待测元素与所选内标元素响应信号值的比值为纵坐标，绘制标准曲线。将空白溶液和试样溶液分别注入电感耦合等离子体质谱仪中，测定待测元素和内标元素的信号响应值，根据标准曲线得到消解液中待测元素的浓度。试样中待测元素的含量按下式计算：

表4 样品消解仪参考条件Tab.4 Reference conditions of sample digester

表5 电感耦合等离子体质谱仪操作参考条件Tab.5 Reference operation conditions of inductively coupled plasma mass spectrometer

式中：X-试样中待测元素含量，单位mg/kg或mg/L；ρ-试样溶液中被测元素质量浓度，单位为μg/L；ρ0-试样空白液中被测元素质量浓度，单位为μg/L；V-试样消化液定容体积，单位为mL；f-试样稀释倍数；m-试样称取质量，单位为g；1000-换算系数。计算结果保留3位有效数字。

1.2.7 亲本株、缺失株体外培养生长曲线的测定 将冻存的亲本株PMI和敲除株△modABC分别以1∶100的比例接种至5 mL LB液体培养基中，37 ℃振荡培养过夜后，从中取出1 mL菌液12 000 r/min离心2 min，无菌1×PBS清洗2遍，用1 mL无菌1×PBS重悬，调整菌液A600nm值一致至约0.6，再取重悬菌液以1∶100的比例分别接种至LB液体培养基，以此为起始测试点，用PBS调零，每隔2 h测其A600nm值。重复测量3次，并取均数值绘出生长曲线图。

厌氧生长操作如上，由于尿路感染环境中存在硝酸盐，同时钼酶参与奇异变形杆菌厌氧硝酸盐还原，将还原为，对细菌的厌氧生长至关重要，且在硝酸盐存在的情况下奇异变形杆菌仅表达钼酶中的硝酸还原酶，而在硝酸盐不存在的情况下奇异变形杆菌除钼酶外还表达延胡索酸酶。因此在培养基中考虑添加硝酸盐进行实验。将重悬菌液分别接种至添加20 mmol/L和不添加20 mmol/L硝酸钾的LB液体培养基，置于厌氧罐密封培养，每隔3 h测定。

1.2.8 统计学分析 统计学分析采用SPSS 25.0软件，钼离子含量比较采用独立样本t检验，生长曲线采用双因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 modABC基因缺陷同源性打靶片段的扩增

以亲本株PMI基因组为模板，用引物对modABCAF/AR、modABC-BF/BR 及modABC-KnF/KnR 分别PCR 扩增出modABC基因同源性上下游片段及卡那霉素抗性基因片段，大小分别为741 bp、729 bp、927 bp（图2A）。以纯化的上、下游片段为模板，用modABCAF、modABC-BR引物成功融合PCR扩增modABC基因缺陷同源性片段，大小为2337 bp，PCR产物大小相符（图2B）。

图2 基因缺陷同源性打靶片段的扩增Fig. 2 Amplification of homologous arms of modABC gene.A:Homologous arm amplification of modABC.M: DNA molecular weight standard.Lane 1:Amplification product of upstream homologous recombination arm (741 bp);Lane 2:Amplification product of downstream homologous recombination arm (729 bp);Lane 3: Amplification product of kanamycin resistance gene (927 bp). B: Fusion PCR amplification.M: DNA molecular weight standard.Lane 1:Target fusion gene (upstream homologous recombination arm-kanamycin resistance gene-downstream homologous recombination arm,2337 bp).

2.2 modABC基因缺失株的的筛选

采用内部引物和外部引物对接合实验后的菌株进行筛选（图3A），内部引物PCR扩增结果显示：以亲本株PMI为模板时此对内部引物扩增序列长度为263 bp，1-14号克隆均为阴性扩增（图3B）。采用外侧引物进一步验证，结果显示，亲本株PMI外侧引物扩增产物长度为4143 bp，为modABC基因特异性条带，第1 号克隆扩增产物长度为2645 bp，为Kn抗性基因特异性条带（图3C）。上述结果表明，modABC已被敲除。

图3 基因缺失株的的筛选Fig. 3 Screening of gene deletion strains,A:Map of gene positions on both sides and the primers.The gray arrow indicates the ORF region of the genes.The external primer pair (outF/R) and internal primer pair(inF/R)are marked.B:Identification of gene internal primer mutant screening.M:DNA molecular weight standard.Lanes 1-14: Internal primer amplification products of clone 1-14.Lane 15: Internal primer amplification product of the wild-type strain (263 bp);Lane 16: Amplification product of the negative control without template.C:Identification of mutant screening of the fusion gene with external primers.M:DNA molecular weight standard.Lane 1:Amplification product of the external primer of clone 1(2645 bp);Lane 2:Amplification product of the wild-type strain external primer(4143 bp);Lane 3:Negative control.

2.3 测序验证

将PCR扩增产物送测序验证，测序结果显示，目标基因位置被卡那霉素抗性基因Kn替代，与设计一致。从卡那霉素抗性基因Kn的起始密码子ATG开始翻译，通读Kn，最后终止于Kn基因翻译的终止密码子TAA（图4）。确定此克隆为modABC基因敲除克隆，命名为：Pmi/ΔmodABC::Kn。

图4 PCR扩增产物Sanger测序图Fig. 4 Sanger sequencing of PCR amplification products. A: Forward sequencing; B: Reverse sequencing.

2.4 modABC缺失导致奇异变形杆菌体内钼酸盐含量下降

采用电感耦合等离子质谱法进行奇异变形杆菌钼离子检测结果如图所示，敲除了modABC基因后，敲除株体内钼酸盐含量约为1.22±0.02 mg/kg，与亲本株PMI的钼含量1.46±0.02 mg/kg的相比明显减少（图5），差异有统计学意义（P<0.05）。

图5 奇异变形杆菌菌体内钼离子含量Fig. 5 Concentration of molybdate in Proteus mirabilis.***P<0.001.

2.5 modABC缺失导致PMI的厌氧硝酸盐生长受限

亲本株PMI和敲除株在LB培养基中的有氧生长能力无明显差异，其生长趋势基本一致，进入对数生长期和平台期的时间点也基本一致，都在约在2 h后进入生长的增殖期，至约14 h趋于稳定（图6A）。在厌氧条件下，二者的细菌的增殖总数远低于有氧培养细菌总数，当敲除了modABC基因后，在不添加20 mmol/L硝酸盐的LB培养基中的厌氧生长能力基本一致，均在前3 h快速生长，而后缓慢生长（图6B）。然而，敲除株在了添加20 mmol/L硝酸盐的LB培养基中的厌氧生长能力低于亲本株PMI，二者生长趋势一致，前3 h快速生长，随后进入平台期（图6C，P<0.05）。

图6 奇异变形杆菌LB培养基生长曲线Fig. 6 Growth curve of Proteus mirabilis in LB medium,**P<0.005,***P<0.001. A: Aerobic growth. B: Anaerobic growth. C: Anaerobic growth.

3 讨论

钼酸盐转运蛋白ModABC由modABC编码，是细菌内负责转运钼酸盐合成钼酶的主要转运蛋白［7-13］。奇异变形杆菌利用钼酶中的硝酸盐还原酶还原尿中硝酸盐为亚硝酸盐，作为呼吸酶系统的终末受氢体，尿路的混合感染增加了细菌对厌氧硝酸还原酶系统的需求［2］。多项研究证实，modABC基因与细菌毒力及致病性相关。研究发现敲除modA基因后，铜绿假单胞菌钼酸盐浓度下降，导致在硝酸盐含量减少及在缺氧环境下生长受限，并引起铜绿假单胞菌菌膜形成能力以及脂肪酸构成发生改变［8,11,15］。肺炎克雷伯菌的全局调控因子与modABC基因表达存在相关性，与细菌毒力相关，并通过ModABC转运蛋白在宿主体内转运钼酸盐进行厌氧硝酸盐呼吸，产生适应性优势，增强侵袭性，促进肌肉感染［11］。钨酸盐作为钼的竞争性抑制剂消除厌氧呼吸所赋予的适应性优势，并选择性地抑制肠杆菌科细菌的侵袭以改善肠道炎症。modA转座子插入突变体削弱了小鼠肺部的增殖和毒力，Mo的转运与结核分枝杆菌毒力也存在相关性［14,17］。目前国内外对modABC在奇异变形杆菌致病中的作用尚无任何报道，关于modABC在奇异变形杆菌中的作用仍待研究。临床上奇异变形杆菌致尿路感染的情况日趋严重，对modABC与奇异变形杆菌毒力及致病性的研究显得尤为重要。构建突变株是研究细菌相关致病基因功能的重要途径和方法，利用基因敲除对探究奇异变形杆菌的modABC基因在致病过程中的功能至关重要。

用于研究微生物基因功能的同源重组基因敲除的方法包括自杀载体同源重组和Red同源重组等。彭亮等［18］提出相比于用λRed同源重组技术进行PMI的基因敲除，自杀载体系统的一次重组效率高，可进行框内缺失突变实现单纯的基因阅读框内碱基序列的缺失，且可避免极性效应的产生。同时，国内外已有许多基于自杀载体同源重组的基因敲除技术的报道［9,19,20］。因此本研究采用基于自杀载体的同源重组法构建modABC基因缺失突变株。通过同源重组技术，利用含反向筛选基因sacB（蔗糖致死基因）的pCVD442 质粒构建modABC的缺失突变株，主要分2步，当含有同源臂的自杀载体导入目的菌株时，在生存压力下发生第一轮单交换，自杀载体与染色体DNA 发生同源重组，而后在反向筛选的压力下发生第二轮的单交换消除质粒，以在蔗糖平板上生长，最终将基因敲除，成功构建奇异变形杆菌modABC基因敲除株以研究其在菌株摄取钼酸盐、体外有氧及厌氧环境下培养的生长能力的改变，重组效率高，有效避免了对上下游基因造成的潜在极性效应。

modABCD基因在至少20多种细菌菌属和古细菌菌属中被鉴定报道［12,21-24］。ModABC蛋白在多种细菌中被证实是具有高亲和力的钼酸盐转运系统，转运到细菌体内的钼不仅以钼辅因子的形式参与钼酶的合成，也可通过反式抑制（即高胞质浓度的游离钼酸盐通过保持ModC与ModB的分离来抑制转运蛋白，这一现象称为反式抑制）调控modABC的表达［8,10,13,25］。钼酶在细菌中的生理作用包括硫化物氧化、芳香族化合物降解以及支持细菌中的厌氧呼吸，从而支持细菌能量的产生，其次与细菌毒力相关，在感染过程中对细菌适应性起着核心作用［7,26-28］。多项研究证实modABC与某些细菌的致病性有着非常重要的关系。在缺乏有效钼摄取的情况下，细菌的毒力显著降低，生物被膜形成受到影响，因此钼酸盐转运蛋白ModABCD是潜在的药物靶点。为了研究modABC与奇异变形杆菌致尿路感染的关系,我们首先通过ICP-MS方法明确modABC在奇异变形杆菌钼酸盐转运中的作用。ICP-MS的结果表明modABC基因的缺失导致奇异变形杆菌胞内钼酸盐含量下降，先前在铜绿假单胞菌中对modABC基因中的modA基因的钼酸盐和厌氧硝酸盐生长的研究结果也显示出相似的趋势［7］。我们的结果表明modABC的缺失使奇异变形杆菌无法合成高亲和力的钼酸盐转运体转运钼酸盐，说明modABC基因参与调控奇异变形杆菌钼酸盐的转运。

转运至细菌体内的钼酸盐在厌氧呼吸中起着重要作用，它厌氧呼吸是第一阶硝酸盐还原途径（将NO3-还原为NO2-）中钼辅助因子的组成部分［11,13,15,29］。奇异变形杆菌可形成四种还原酶，作为厌氧呼吸链的末端氧化酶起作用，包括硝酸还原酶，氯酸盐还原酶，连四硫酸盐还原酶和延胡索酸还原酶，其中前三种酶已被鉴定为钼酶。在硝酸盐存在的厌氧生长期间，细菌仅形成钼酶中的硝酸盐还原酶，其他三种还原酶的形成受到抑制；在没有硝酸盐的厌氧生长期间，细菌仅形成氯酸还原酶，连四硫酸盐还原酶和延胡索酸还原酶［25］。从生长曲线结果可见，在有氧培养条件下，ΔmodABC和PMI菌株在LB 液体培养基中具有相似的增殖曲线，说明modABC基因的缺失对细菌的有氧生长未产生明显影响。厌氧条件下，与有氧条件下生长曲线相比，敲除株和亲本株的生长速率下降（图6B），由此可见厌氧条件可抑制奇异变形杆菌的增殖。不添加硝酸盐情况下，与亲本株相比，modABC基因的缺失不影响敲除株的增殖速率（图6B），而在添加20 mmol/L 硝酸盐条件下，modABC基因的缺失使得细菌的厌氧生长明显受到抑制（图6C）。这可能是由于在无硝酸盐的培养基中，敲除株虽无法合成氯酸盐还原酶和连四硫酸盐还原酶这两种钼酶，但仍可以依靠非钼酶延胡索酸酶进行厌氧呼吸，而在硝酸盐存在的条件下，由于细菌仅形成硝酸还原酶，敲除modABC基因导致细菌转运钼酸盐能力受损，从而导致钼酸盐以钼辅因子形式合成硝酸还原酶的能力受限。硝酸盐还原酶作为奇异变形杆菌厌氧呼吸第一阶段的关键酶，它的合成受限使得敲除株的厌氧呼吸被抑制。这些结果提示modABC基因通过转运钼酸盐参与钼酶的合成，促进细菌的厌氧生长，并且在硝酸盐存在的厌氧条件下具有更强的生长优势。UTI患者尿路的混合感染增加了对硝酸还原酶系统的需求，尿道的硝酸盐环境为细菌的厌氧硝酸盐生长提供了便利。此外，由于导尿管的使用，奇异变形杆菌致UTI患者易于形成生物被膜从而形成细菌的厌氧环生长环境，因此，modABC基因可能通过调节细菌在尿路感染患者的尿道环境的厌氧硝酸盐生长而在UTI的致病中发挥重要作用，具有更其具体机制还需要进一步深入研究。

本研究利用自杀载体pCVD442通过同源重组的方法成功构建了奇异变形杆菌modABC基因缺失突变株，为后续modABC操纵子上各个结构基因敲除株构建提供基础。本研究首次明确modABC基因在奇异变形杆菌体内执行转运钼酸盐的功能，并且modABC基因在细菌生长代谢过程中调控奇异变形杆菌厌氧硝酸盐生长，为进行后续试验深入研究modABC基因各个结构基因的生物学功能提供思路。然而尚未明确modABC基因在细菌毒力和致病力方面的作用，这将是进一步深入研究的方向，为最终阐明modABC在奇异变形杆菌致尿路感染中的机制奠定基础。