AF4/FMR2、IL-10基因多态性与强直性脊柱炎的遗传易感性和免疫浸润相关

穆 杰，徐永申，朱 辉

河南科技大学第二附属医院骨科，河南 洛阳471000

强直性脊柱炎（AS）是一种主要侵犯骶髂关节和脊柱，并累及周围关节的慢性进展性炎性疾病，主要病理表现为附着点炎［1］。该病多发于青壮年男性，病程长易发展成残疾［2］，且本病的发病机制仍不明确，因此，对AS的发病机制研究十分重要。流行病学调查发现，AS的易感性与遗传有较强相关性，且遗传同时影响环境因素［3,4］。家系研究发现，在AS患者的直系亲属中AS的患病率比正常人高20～40倍，对孪生人群的研究结果更支持该观点［5］。单卵孪生人群中AS患病的一致率超过50%，HLA-B27阳性的双卵双生双胞胎的AS一致性率超过20%。然而，HLA-B27阳性与AS并非绝对相关，HLA-B27阴性者也可发生AS，而脊柱关节病病人的HLA-B27检测可为阴性［6,7］。在HLA-B27阳性个体中只有5%最终会发展为AS，提示AS的发病除了HLA-B27外，还存在其他易感基因参与。

AF4/FMR2家族基因编码一类转录因子，该转录因子优先在淋巴样细胞（ILC）上表达，与淋巴系统的功能有关，参与多种炎症、免疫相关疾病的发生发展［8,9］。Barton等［10］2009年首次报道AFF3基因单核苷酸多态性（SNP）与类风湿关节炎（RA）的易感性。研究发现RA患者外周血AFF3的表达明显下调，差异基因富集分析发现，AFF3位于机体对刺激的反应通路。AS与RA病理改变有部分相似，如AS也有滑膜炎改变，病理表现为滑膜细胞肥大和滑膜增生，有明显的淋巴细胞和浆细胞浸润，以及自身抗体的产生。Hinks等［11］报道在幼年特发性关节炎中AFF3 与IL2、IL21 基因区域相关。Zhou等［12］研究表明AFF1和AFF4对人骨髓间充质干细胞成骨分化有不同的调节作用。

IL-10 是由染色体1q31-32 上的IL-10 基因编码的一种免疫调节细胞因子，IL-10基因有四个内含子和五个外显子，其中，位于5′端的多态性-1082A>G，-819T>C，-592A>C，尤其是-1082A>G，参与调节IL-10的生成［13］。IL-10具有抗炎特性，通过限制对病原体的免疫反应，从而防止对宿主的损害。Braga［14］分析了IL-10基因启动子区域-1082A/G与AS的易感性，发现显性模型中的AG基因型与AS风险相关。不同人群来源的AS易感性结果不尽相同，IL10-1082 A>G对AS遗传易感性没有显著影响［15］。但是，基因相互作用分析发现，TNF-α-308（GA/AA）/IL-10-1082AA 基因型对AS 具有协同保护作用。虽然上述研究提供了AF4/FMR2和IL-10在慢性炎症性疾病发病机制中的重要性，但AF4/FMR2和IL-10基因与环境之间是否存在相互作用，共同引起AS。目前未发现AF4/FMR2家族基因多态性与AS 的相关研究。我们通过本该病例对照研究，探讨AF4/FMR2家族基因与AS的遗传易感性，以及基因-基因，基因-环境交互作用与AS 的相关性。并对AF4/FMR2和IL-10互作关系的基因进行信号通路及基因富集分析。同时对AF4/FMR2和IL-10基因进行免疫相关性分析，进一步评估潜在的发病机制。

1 资料和方法

1.1 研究对象

该研究为病例对照研究，共纳入了207例AS 患者和321例对照者。病例组来自于2015年1月～2019年12月期间就诊于我院的AS患者。选择同时期来自于健康体检中心的人群为对照组。所有参与者全部进行了脊柱和骨盆CT检查。AS诊断按照1984年修订的AS诊断标准［16］，及ESSG诊断标准［17］。所有诊断AS的患者都有相关检查并符合AS的诊断。既往有腰椎感染、腰部外伤、结缔组织疾病史者不纳入本研究，对照组同时排除AS及其他风湿免疫性疾病。收集参与者的性别、发病年龄、血沉、C-反应蛋白、HLA-B27阳/阴性、吸烟史、饮酒史、临床症状和计算机断层扫描结果等信息。本研究经过医院伦理委员会批准，所有受试者都签署了知情同意书。

1.2 SNP选择

通过检索NCBI 的SNP 数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP），应用Haploview软件选择，参照标准为北京汉族人群，以最小等位基因频率≥0.05和R2≥0.8，选 取AF4/FMR2 家族基因的tag SNP（AFF1 基因rs340630、AFF2基因rs241084、AFF3基因rs10865035、AFF4基因rs1698105、IL-10 rs1800896）。

1.3 DNA提取与基因分型

抽取受试者的外周血，经EDTA抗凝，提取DNA后保存在-20 ℃冰箱。应用SeCore试剂盒（LifeTechnologies）中提供的引物进行等位基因PCR，然后对目标基因进行测序。

1.4 统计分析

本研究数据分析应用软件SPSS 22.0版本（USA.SPSS）。测量数据以均数±标准差表示，采用独立样本t检验评价AD患者与对照组之间的差异。用χ2检验分析人群是否符合Hardy-Weinberg平衡。AS和对照组的基因型和等位基因频率分布差异用χ2检验比较分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

发病风险用比值比（OR）和95%置信区间（CI）表示。基因-基因和基因-环境的相互作用通过GMDR进行分析。交叉验证一致性（CVC）和符号检验最大值的模型为最佳模型，P<0.05。

功能富集分析方法：通过GeneMANIA工具分析各基因的交互网络。通过metascape进行信号通路和基因本体（GO）富集分析，P值<0.01、最小计数为3、富集因子>1.5。

免疫相关性分析方法：通过秩和检验检测两组数据的差异，使用R软件v4.0.3进行统计分析，P<0.05表示差异有统计意义。

2 结果

2.1 研究对象

研究参与者的一般特征（表1）。本研究共纳入207例AS患者和321例正常对照。AS组采血时平均年龄51.75±11.33岁，男性131例。对照组采血时平均年龄52.37±10.87岁，男性233例。病例组与对照组的年龄无统计差异（P=0.082）。性别、吸烟、血沉、C反应蛋白，在AS组与对照组有统计学差异（P<0.05）。

表1 病例组与对照组的一般特征Tab.1 General characteristics of case group and control group

2.2 基因型和等位基因分布

AS组和对照组基因标签SNP的基因型和等位基因分布特征（表2）。目标基因SNP的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡。AFF1基因rs340630基因型和等位基因分布频率在AS组和对照组之间存在差异（分别为P=0.003、P=0.001）。IL-10 基因rs1800896 的等位基因频率分布在AS 组和对照组之间的存在差异（P=0.026）。其余基因的标签SNP基因型和等位基因病例组和对照组的分布无统计学差异（P均>0.05）。

表2 病例组和对照组的SNP基因型和等位基因分布情况Tab.2 Distribution of SNP genotypes and alleles in case group and control group

2.3 目标基因的基因模型分析结果

目标基因的基因模型分析结果（表3），AFF1 rs340630 的显性模型、隐性模型在AS 组与对照组之间有显著性差异（分别为P=0.031、P=0.010）。AFF3 rs10865035、IL-10 rs1800896的隐性模型A在S组与对照组有显著性差异（分别为P=0.031、P=0.019）。rs241084、rs1698105在AS组与对照组的基因模型分析均未发现统计学差异（P均>0.05）。

表3 目标基因SNP不同遗传模型在AS和对照组的对比分析结果Tab.3 Genotyping models in patients withAS and control subjects

2.4 基因-基因相互作用分析

GMDR用于分析六个SNP的相互作用（表4）。最佳模型 是AFF1 rs340630，AFF2 rs241084，AFF3 rs10865035，AFF4 rs1698105，IL-10 rs1800896 五因素相互作用模型，经过1000次排列测试后，其最大CVC（10/10），且该模型有最大Sign Test值（10）和最大的检验精准度（0.5935），P=0.0025。

表4 广义多因子降维法分析基因-基因交互作用与AS的发病风险Tab.4 Generalized multifactor dimensionality reduction analysis of gene-gene interactions andAS risk

2.5 基因-环境相互作用

GMDR用于分析基因-环境的相互作用与AD风险之间的关联（表5）。该模型中考虑了5个SNP和潜在的AS的危险因素，包括吸烟，饮酒，性别。分析结果提示：最佳模型是AFF1 rs340630，AFF2 rs241084，AFF3rs10865035，AFF4 rs1698105，IL-10 rs1800896，吸烟史，饮酒史的七因素相互作用模型，该模型经过1000次排列测试后交叉验证一致性为10/10，且该模型有最大Sign Test值（10）和最大的检验精准度（0.7081），P=0.0010。

表5 广义多因子降维法分析基因-环境交互作用与AS的发病风险Tab.5 Generalized multifactor dimensionality reduction analysis of gene-environment interactions andAS risk

2.6 基因功能富集分析

与AF4/FMR2、IL-10有交互作用的基因，共25个（图1A）。为了进一步分析25个基因相关信号通路及生物学过程富集情况，如KEGG通路、GO生物过程、标准通路等。结果发现：以上基因在AFF4超级延伸复合物、白细胞介素家族信号转导、细胞因子刺激反应、凋亡过程的正调控、对糖皮质激素的反应、染色质重塑、细胞对应激反应的调节等（图1B，表6）。此外，还参与了白血病、脊柱关节炎等疾病的生物进程（图1C）。

图1 基因功能富集分析Fig. 1 Gene function enrichment analysis. A: The genes that interact with AF4/FMR2 and IL-10. B:Signal pathway enrichment network diagram.Different colors represent different signal pathways.C:GO enrichment analysis.

表6 最具有代表性且最显著的GO富集分类Tab.6 Top clusters with their representative enriched terms

2.7 免疫相关性分析（TIMER）

基因表达水平在多个肿瘤组织中的免疫浸润评分的spearman相关分析热图（图2）。其中横坐标代表不同的免疫浸润评分，纵坐标代表不同细胞类型。相关系数r>0代表正相关，<0代表负相关，颜色越深相关性越强。结果提示：AF4/FMR2家族（尤其是AFF3）、IL-10基因表达水平与多种类型免疫浸润成正相关（r>0）。

图2 关键基因的免疫相关性分析Fig. 2 Immunological correlation analysis of the key genes. A: AFF1. B: AFF2. C:AFF3. D: AFF4. E: IL-10.A darker color indicates a stronger correlation.

3 讨论

强直性脊柱炎的主要病理过程是以关节囊、肌腱、韧带的骨附着点为中心的慢性炎症［18］。AF4/FMR2家族基因编码的蛋白属于转录激活因子，定位于细胞核，对RNA的转录具有促进作用，参与多种疾病的炎症与免疫反应的过程［19］。本研究通过对AF4/FMR2家族基因单核苷酸多态性与AS易感性的关联分析，发现AFF1、AFF3基因多态性与AS的遗传易感性相关。AFF1基因rs340630 的AA 基因型、AFF3 基因rs10865035 的GG基因型、IL-10基因rs1800896的GG基因型发生AS的风险增加，吸烟、饮酒为AS发病的危险因素。

多项研究报道AFF3与炎症及自身免疫疾病，如RA［20］、系统性红斑狼疮［21］和青少年特发性关节炎［22］的遗传易感性有关。在欧洲和亚洲裔等多个种族，AFF3基因多个位点SNP与RA的遗传易感性研究发现，rs10865035、rs9653442、rs7608424、rs6712515、rs11681966多态性影响AFF3的表达水平，但未发现与RA的相关性［20］。有研究报道AFF3基因多态性与RA患者应用肿瘤坏死因子-α抑制剂的治疗效果有关［23］。Hinks等［11］报道AFF3与青少年特发性关节炎相关［23］。研究发现，欧洲人中AFF3基因rs10865035与RA遗传易感性有关。本研究发现AFF3基因rs10865035位点的基因型频率和等位基因频率在AS病例组与对照组间均无统计学差异，但该位点风险等位基因在隐性遗传模型下与AS的遗传易感性有关。AFF3基因是AF4/FMR2家族的核转录因子成员，编码包含转录激活结构域的核因子，优先选择在淋巴样细胞中表达。rs10865035位于AFF3基因上游的5'启动子区域，它编码可与DNA相互作用的核因子。AFF3的遗传变异导致淋巴细胞炎症反应异常激活，从而导致更多的促炎分子的表达。

本研究发现，AFF1基因rs340630 GA和AA基因型与AS增加风险有关。由于AFF1主要表达于外周血CD4+与CD19+淋巴细胞中［24,25］，在辅助性T细胞与B细胞中发挥重要作用，AFF1的上调可能导致这些淋巴细胞的生物学功能异常，从而参与AS发病。本研究中，rs340630的显性遗传模型与AS遗传易感性无明显关系。Okada等2012［24］的全基因组关联研究确定AFF1是日本人SLE 的易感基因。Cen 等［21］研究AFF1 基因rs340630和AFF3基因rs10865035多态性与中国人群SLE的易感性，结果提示，AFF1基因rs340630与SLE未发现明显关联。Sun等［25］关于AFF1基因rs340630多态性与中国人群类风湿关节炎遗传易感性的研究，结果表明无论是基因型频率分布还是等位基因频率分布均未发现统计学差异。Zhou 等［12］的研究表明AFF1 和AFF4对人骨髓间充质干细胞成骨分化有不同的调节作用。AFF1和AFF4通过延伸和染色质重塑调节转录，AFF1沉默导致碱性磷酸酶活性增加，骨化增强和成骨相关基因表达上调，AFF1和AFF4的过表达影响体外成骨分化和体内间充质干细胞介导的骨形成。AFF4是转录延伸因子，是连接转录因子并通过延伸和染色质重塑促进基因转录的支架蛋白。Xiao等［26］通过分析AFF4对人牙囊细胞成骨分化的影响，发现AFF4沉默导致ALP降低和矿化受损，与成骨相关的基因表达明显下调，相反AFF4过表达显著增强人牙囊细胞的成骨潜能，上调关键调节因子的mRNA和蛋白质水平，促进人牙囊细胞的成骨分化。

IL-10基因rs1800896隐性模型GG与AS的易感性相关。另一项来自欧洲的研究也发现IL-10 基因rs1800896（-1082A>G）多态性和AS相关，其中，AG和GG基因型携带者更可能发展为AS［14］。IL-10是主要的免疫调节细胞因子，作用于免疫系统的多种细胞，具有抗炎功能，能够限制炎症引起的组织损伤。然而，AS患者的血清IL-10水平更高。可能的机制是IL-10通过M2巨噬细胞作用引起AS。研究发现，在AS患者的滑膜活检组织、炎症性肠道中M2 CD163+的表达增加，并且CD163滑膜过度表达与AS相关，IL-10可以将巨噬细胞的表型从M1 改变为M2［27,28］。此外，IL-10 基因rs1800896（-1082A>G）被报道与多种肿瘤疾病有关［29］。我们在免疫相关性分析中也发现，IL-10与免疫相关的多种炎症的正相关关系。

AS发病受遗传和环境影响，本研究发现，吸烟和饮酒增加AS的患病风险，性别、年龄对发病风险未见显著影响。Doran等［4］的研究发现，吸烟为影响AS功能状态的独立危险因素，这同我们的研究结果一致。吸烟导致的炎症反应可能会加重关节炎和关节损害［30］。Roseman等［31］研究发现，吸烟者患有关节炎时其炎症标记物含量较高，吸烟导致甲氨蝶呤治疗的RA患者免疫异常，炎症标志物CRP、ESR升高，IgG水平降低，饮酒未发现明确影响。Lu等［32］发现，每周喝啤酒2～4次的女性患RA的风险降低了31%，但目前未见到关于饮酒与AS发病风险的相关研究。

本研究存在以下不足：（1）分析了AF4/FMR2、IL-10基因单核苷酸多态性与AS的遗传易感性，但是未进行转录、调控等相关研究；（2）可进行细胞或动物研究进一步验证突变位点是否引起AS，及致病机制；（3）进行多中心的更大样本的研究也是有必要的。强直性脊柱炎的表现复杂多样，纳入这些（如外周关节炎等）因素会引起统计量增加，同时样本量要增加，考虑到统计分析对于样本量的严格要求，分组太多则不利于SNP数据的分析及GMDR分析，因此，没有按照外周关节炎等因素单独分组。综上，AFF1 rs340630、AFF3 rs10865035、IL-10 rs1800896与AS的遗传易感性有关。AF4/FMR2、IL-10、吸烟史、饮酒史的相互作用参与AS。AF4/FMR2、IL-10通过多个信号通路引起AS，且与免疫浸润有关。