益肺健脾方降低香烟烟雾诱导的人支气管上皮细胞的炎性损伤和黏液高分泌：基于抑制TLR4/NF-κB信号通路

徐晨，李春颖，王胜，3，4

安徽中医药大学1研究生院，2第一附属医院老年病中心呼吸内科，安徽合肥 230031；3安徽省中医药科学院中医呼吸病防治研究所，安徽合肥 230031；4安徽省教育厅重点实验室中医药防治肺系重大疾病重点实验室，安徽合肥 230031

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是呼吸系统临床常见病、多发病。在我国，COPD总患病人数约1亿［1］，其中60岁以上人群患病率超过27%，40岁以上人群患病率约13.7%。COPD也是我国病死率第4高的疾病［2］，和糖尿病、高血压成为中国最常见慢性病的“三巨头”［3］。COPD患病人数多，患病人群死亡率高，生活质量和劳动能力严重下降，对家庭和社会经济造成巨大负担，因此成为一个亟需解决的重要公共卫生问题。

目前普遍认为COPD的发病与环境因素有关，主要是由于香烟烟雾（CS）吸入肺部所引发，CS中的尼古丁使气道和肺组织产生炎症反应［4］，加之氧化应激、蛋白酶-抗蛋白酶的失衡和机体功能紊乱等机制相互影响，共同参与发病并进一步加重COPD炎性反应。COPD特征性病理改变为气道的慢性炎症和黏液高分泌［5］，患者出现肺功能进行性下降，黏液高分泌导致多痰，另外患者肺部有肺泡巨噬细胞、T淋巴细胞和中性粒细胞数量增加，释放多种炎症介质包括白介素6（IL-6）、白介素（IL-8）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）及其它炎症介质，这些介质能破坏肺的结构和促进炎症反应从而导致COPD发生发展［6,7］。COPD西医治疗以支气管舒张剂和吸入糖皮质激素为主，其疗效欠佳且副作用较多，病情易反复发作，中医药辅助治疗不仅能延缓疾病进展，提高患者生存质量，减轻患者的经济负担，而且还能降低西药治疗带来的毒副作用［8］。益肺健脾方是临床运用多年且有良效的院内制剂，本课题组前期多项研究均表明，益肺健脾方不仅可以抑制COPD模型大鼠肺组织内核因子-κB（NF-κB）、Toll样受体4（TLR4）蛋白表达，而且还能通过降低COPD患者痰液炎症细胞计数和IL-8、TNF-α水平从而减轻气道炎症和改善气道黏液高分泌，达到防治COPD目的［9-11］。目前已知气道炎症和黏液高分泌是COPD 的显著特征，TLR4/NF-κB 信号参与COPD气道炎症反应，黏蛋白（MUC）是COPD气道黏液高分泌的主要成分。NF-κB 信号不仅可直接诱导MUC的产生和合成，而且还可通过促进炎性细胞因子的释放借助炎性因子的作用间接刺激MUC分泌［12］。据此，我们假设，NF-κB信号级联效应在气道的炎症反应和黏液高分泌状态中具有重要调控作用，针对该效应进行干预可控制COPD的发生发展，但其具体发挥抗炎和抑制气道黏液高分泌的作用机制尚不完全清楚，基于前期研究进一步深入研究，探索益肺健脾方防治COPD可能的分子机制。

1 材料和方法

1.1 实验药物制备

益肺健脾方药物组成：黄芪30 g、党参15 g、白术15 g、茯苓15 g、防风10 g、半夏15 g、陈皮10 g、地龙8 g、款冬花10 g、甘草10 g，购自安徽中医药大学第一附属医院中药房，每剂药物重量138 g。将益肺健脾方药物加入10 倍于药物重量的冷水煎煮1 h 后将药液倒出，药渣再加入8倍重量冷水煎煮40 min后倒出药液，两次药液混合。继续熬制药液浓缩至生药含量1.6 g/mL（即每剂药液共86.25 mL），待药液冷却后用0.22 μm 滤头过滤并放入4 ℃冰箱存用，每次使用时提前取出预热。

1.2 动物和细胞

实验动物选用健康雄性SD大鼠40只，购自安徽医科大学实验动物中心，8周鼠龄，体质量为180～220 g，SPF（Specific Pathogen Free，SPF）级，经安徽省实验动物质量监督检测中心检测合格，自由饮水进食1周后开始动物实验。人支气管上皮样细胞（16HBE），购自上海中乔新舟生物科技有限公司。动物实验伦理经安徽中医药大学实验动物伦理委员会审查合格（伦理审批号：2021027）。

1.3 主要试剂及仪器

DMEM高糖培养基（Gibco）；胎牛血清（HAKATA）；CCK-8试剂盒（AbMole）；TLR4-siRNA（中国汉恒生物公司）；TLR4-RNAi过表达质粒（中国吉凯基因公司）；Lipo800TM转染试剂（中国碧云天生物技术）；TLR4抗体（Proteintech）；NF-κB抗体（Proteintech）；Muc5AC抗体（Boster）；Muc7抗体（Boster）；Muc8抗体（Proteintech）；β-Actin（Proteintech）；羊抗兔IgG-HRP（Proteintech）；羊抗大鼠IgG-HRP（Proteintech）；SDS-PAGE凝胶快速制备试剂盒（Biosharp）；ECL 化学发光底物（Biosharp）；Novostart SYBR qPCR SuperMix Plus（novoprotein）；PrimeScripTMRT reagent Kit with gDNA Eraser （TaKaRa）；PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成；TNF-α ELISA试剂盒（联科生物）；IL-1β ELISA试剂盒（联科生物）；IL-6 ELISA试剂盒（联科生物）；IL-8 ELISA试剂盒（联科生物）；细胞计数仪（上海睿钰生物科技）；荧光倒置显微镜（Olympus）；酶标仪（美国伯腾仪器）；凝胶成像仪（上海天能科技）；实时荧光定量PCR仪（德国罗氏诊断）。

1.4 香烟烟雾溶液（CSE）的制备

自制气体抽动装置，用1支香烟（雄狮牌，每支焦油含量8 mg，尼古丁含量0.7 mg，烟气CO含量10 mg）连接胶管，另一头胶管连接至装有DMEM高糖培养基的无菌培养瓶，开动开关后香烟烟雾抽吸至培养基中，至香烟燃至5 mm处关闭开关，轻轻摇晃培养瓶至无烟雾，0.22 μm滤头过滤CSE后转移至新的无菌培养瓶，酶标仪检测吸光度值A320nm，当A320nm值为1.0（±0.05）时定义该溶液为100%CSE［13］，-80 ℃冰箱贮存，每次实验前取出现配现用。

1.5 方法

1.5.1 益肺健脾方含药血清的制备 将40只SD大鼠随机分为两组：空白血清组、含药血清组，20只/组，根据本课题组前期实验方法［11］，对空白血清组和含药血清组大鼠分别以生理盐水、益肺健脾方药液1 mL/100g灌胃，每日早晚各灌胃1次，连续灌胃3 d。末次灌胃1 h后对大鼠进行麻醉并于无菌状态下腹主动脉采血收集益肺健脾方含药血清。

1.5.2 CCK8法筛选COPD细胞模型最佳造模条件 取处于对数生长期的16HBE，消化、离心、重悬后以1.4（±0.2）×105cells/mL密度均匀铺板，100 μL/孔，放入培养箱中培养24 h。实验设对照组，不同浓度CSE实验组。对照组加入100 μL不含血清的DMEM基础培养基，实验组加入100 μL 含5%、10%、15%、20%、25%CSE 的DMEM基础培养基，并设置不含细胞的空白组，只加入100 μL DMEM基础培养基，每组6个复孔。分别将5块板在造模第6、12、24、48、72 h后取出，每孔加入10 μL CCK8试剂，置于培养箱中培养1 h后取出，用酶标仪检测每孔A450nm值。将对照组A450nm值定义为A对照，实验组A450nm值定义为A实验，空白组A450nm值定义为A空白，并根据CCK8计算公式算出细胞存活率（[A实验-A空白]/[A对照-A空白]×100%），根据细胞存活率筛选出CSE最佳造模浓度及最佳造模时间。

1.5.3 CCK8法益肺健脾方最佳干预条件按照步骤 筛选的最佳造模条件对16HBE细胞进行预处理实验设不同浓度对照组、实验组各5组，对照组分别加入含5%、10%、15%、20%、25%空白血清的DMEM基础培养基100 μL，实验组分别加入含5%、10%、15%、20%、25%益肺健脾方含药血清的DMEM 基础培养基100 μL，每组6个复孔，分别干预COPD细胞模型。另设5组不含细胞的空白组，只加入100 μL DMEM基础培养基。分别将5块板在干预的第6、12、24、48、72 h后取出，每孔加入10 μL CCK8试剂，置于培养箱中培养1 h后取出，用酶标仪检测每孔A450nm值。将对照组A450nm定义为B对照，实验组A450nm定义为B实验，空白组A450nm定义为B空白，并根据CCK8计算公式算出细胞存活率（[B对照-B实验]/[B对照-B空白]×100%），根据细胞存活率筛选出益肺健脾方最佳作用浓度及最佳作用时间。

1.5.4 TLR4基因的沉默及过表达实验 将处于对数生长期的16HBE消化、离心、重悬后以2.0（±0.2）×105/mL密度均匀铺种于6孔板，每孔2 mL完全培养基培养24 h。24 h后细胞长至70%～80%后取出，吸去旧培养液，加入2 mL新鲜完全培养基。准备4支无菌无酶的1.5 mL EP管，各EP管中加入125 μL 37 ℃预热的不含血清及双抗的DMEM高糖培养基，再向其中3管各加入2 μL siRNA或过表达Lv-TLR4质粒，另外1管加入等量的siRNA-NC或Lv-TLR4-NC（阴性对照）质粒，移液枪吹打3～5次，各管再加入4 μL Lipo8000转染试剂，轻轻吹打混匀，室温下孵育10 min使复合物充分结合。实验设实验组及对照组，实验组加入125 μL复合物，共3孔，对照组加入等量的阴性对照复合物。将培养板放入培养箱中继续24～48 h后，取出，qRT-PCR法检测转染效率。

1.5.5 qRT-PCR 法检测益肺健脾方对TLR4 沉默后TLR4/NF-κB通路相关基因的影响 将16HBE细胞消化、离心、完全培养基重悬后以2.0（±0.2）×105/mL密度接种于6孔板，每孔2 mL，培养24 h后将细胞取出，PBS缓冲液清洗细胞2次，实验分组及干预方法如表1所示。

将各实验组的细胞收集，TRIzol 法提取细胞总RNA，使用PrimeScripTMRT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒将总RNA逆转录成cDNA。在无酶EP管中使用Novostart SYBR qPCR SuperMix Plus试剂盒配制反应体系。按照如下反应条件进行PCR扩增：95 ℃初始变性1 min，95 ℃20 s和60 ℃1 min 40个循环。检测指标引物如表2所示。

表2 引物序列Tab.2 Primer sequences for RT-qPCR

得到各组的Cycle threshold（Ct）值后保存，按照2-ΔΔCT法计算基因的扩增倍数。计算公式：A=Ct（目的基因，待测样本）-Ct（内参基因，待测样本）；B=Ct（目的基因，对照样本）-Ct（内参基因，对照样本）；K=A-B；表达倍数=2-K。

1.5.6 qRT-PCR法检测益肺健脾方对TLR4过表达后TLR4/NF-κB通路相关基因的影响 将16HBE细胞消化、离心、完全培养基重悬后以2.0（±0.2）×105/mL密度接种于6孔板，每孔2 mL，培养24 h后将细胞取出，PBS缓冲液清洗细胞2次，实验分为空白组，CSE组，CSE+含药血清组，CSE+Lv-TLR4-NC组，CSE+Lv-TLR4组，CSE+Lv-TLR4+含药血清组，实验方法同1.5.5。

1.5.7 Western blot检测益肺健脾方对TLR4沉默和过表达后TLR4/NF-κB通路相关黏蛋白的影响 实验分组同1.5.5、1.5.6。将处理好的细胞收集，加入蛋白裂解液后提取蛋白并变性处理，制备SDS-PAGE凝胶后进行蛋白上样，电泳并转膜至PVDF膜上，封闭1 h后加入一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗膜30 min，加入相应的二抗孵育1 h，TBST洗膜30 min后曝光。拍摄条带，Image J软件计算每个条带的灰度值，绘图。

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1.5.8 ELISA实验 分组同1.5.5，1.5.6。按照上述分组处理细胞后，收集各组细胞上清。参照ELISA试剂盒说明书，加入300 μL 1×洗液浸泡酶标板并静置30 min；标准品孔加入100 μL 2 倍倍比稀释的标准品，空白孔加入100 μL 样本稀释液，样本孔加入100 μL 细胞上清，加入稀释过的抗体50 μL，封板膜封板，300 r/min 震荡，室温孵育2 h；加入300 μL 洗涤液洗涤6 次，之后每孔加入100 μL 辣根过氧化物酶标记的链酶亲和素；重新封板、洗涤；最后每孔加入100 μL TMB显色底物，避光孵育20 min；每孔加入100 μL 终止液，酶标仪测定吸光度值A450nm。

1.5.9 统计学方法 采用SPSS26.0统计软件进行统计分析。数据均以均数±标准差表示，组间比较采用配对t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CSE最佳造模浓度和时间的确定

CCK8结果显示，在CSE作用浓度相同的情况下，CSE作用时间越长，细胞存活率越低，抑制作用越强。在CSE作用时间相同的情况下，CSE作用浓度越大，细胞存活率越低，抑制作用越强。与20%浓度CSE作用6 h相比，作用24 h后细胞存活率可见显著降低（P＜0.05）；与20%浓度CSE作用12 h相比，作用24 h后细胞存活率可见显著降低（P＜0.05）。因此选择20%浓度CSE作用24 h作为CSE刺激16HBE的最佳造模浓度及造模时间（图1）。

图1 不同浓度CSE在不同作用时间下16HBE细胞存活率Fig.1 Survival rate of 16HBE cells treated with different concentrations of cigarette smoke extract(CSE)for different durations.*P＜0.05 vs 20%CSE for 6 h;#P＜0.05 vs 20%CSE for 12 h.

2.2 益肺健脾方最佳给药浓度和时间的确定

CCK8结果显示，在益肺健脾方含药血清作用浓度相同的情况下，益肺健脾方含药血清作用时间越长，细胞增殖率越高。在益肺健脾方含药血清作用时间相同的情况下，益肺健脾方含药血清作用浓度越大，细胞增殖率越高。与15%浓度含药血清作用24 h相比，20%浓度含药血清作用24 h后细胞增殖率可见显著升高（P＜0.01）；与20%浓度含药血清作用12 h相比，20%浓度含药血清作用24 h 后细胞增殖率可见显著升高（P＜0.01）。结合实验结果选择20%含药血清作用24 h作为益肺健脾方最佳给药浓度及给药时间（图2）。

图2 不同浓度不同作用时间含药血清干预COPD细胞增殖率Fig.2 Proliferation of YifeiJianpi Recipe (YFJP)medicated serum different concentration and time on the activity of COPD cell.*P＜0.05 vs 15% YFJP medicated serum for 24 h;#P＜0.05 vs 20% YFJP medicated serum for 12 h.

2.3 TLR4基因沉默和过表达后16HBE中TLR4 mRNA的表达

通过qRT-PCR 法测定各组16HBE 细胞中TLR4 mRNA的表达，结果显示：与空白对照组相比，CSE组TLR4 mRNA表达升高，差异具有统计学意义（P＜0.01）；与CSE组相比，CSE+siRNA TLR4组TLR4 mRNA降低，CSE+Lv-TLR4组TLR4 mRNA表达升高，差异均具有统计学意义（P＜0.01、图3）。

图3 TLR4 mRNA相对表达量Fig.3 Relative expression of TLR4 mRNA.A:Control;B:CSE;C:CSE+siRNA TLR4-NC;D:CSE+siRNA TLR4;E:CSE+Lv-TLR4-NC;F:CSE+Lv-TLR4.*P＜0.01,#P＜0.01 vsA.

2.4 益肺健脾方对TLR4沉默后TLR4/NF-κB通路相关黏蛋白及基因的影响

通过Western blot和qRT-PCR法测定益肺健脾方对TLR4基因沉默后相关蛋白及基因表达的影响，结果显示：与空白对照组相比，CSE 组的TLR4、NF-κB、MUC5AC、MUC7、MUC8蛋白和mRNA的相对表达量增多，差异具有统计学意义（P＜0.01）；与CSE组相比，CSE+含药血清组的TLR4、NF-κB、MUC5AC、MUC7、MUC8蛋白和mRNA的相对表达量减少，差异具有统计学意义（P＜0.01）；与CSE+含药血清组相比，CSE+siRNA-TLR4+含药血清组的TLR4、NF-κB、MUC5AC、MUC7、MUC8蛋白和mRNA的相对表达量减少，差异具有统计学意义（P＜0.01、图4、5）。

图4 各组TLR4、NF-κB、MUC5AC、MUC7、MUC8蛋白平均相对表达量Fig.4 Relative expression of TLR4,NF-κB,MUC5AC,MUC7,and MUC8 proteins in each group.A:Control;B:CSE;C:CSE+YFJP serum;D:CSE+siRNA TLR4-NC;E:CSE+siRNA-TLR4;F:CSE+siRNA-TLR4+YFJP serum.*P＜0.01 vs A;#P＜0.01 vs B;▲P＜0.01 vs D;▼P＜0.01 vs C.

图5 各组TLR4、NF-κB、MUC5AC、MUC7、MUC8 mRNA平均相对表达量Fig.5 Relative expression of TLR4,NF-κB,MUC5AC,MUC7,and MUC8 mRNAin each group.A:Control;B:CSE;C:CSE+YFJP serum;D:CSE+siRNATLR4-NC;E:CSE+siRNA-TLR4;F:CSE+siRNA-TLR4+YFJP serum.**P＜0.01 vs A;##P＜0.01 vs B;▲▲P＜0.01 vs D;*P＜0.05 vs C.

2.5 益肺健脾方对TLR4过表达后TLR4/NF-κB通路相关黏蛋白及基因的影响

通过Westernblot和qRT-PCR法测定益肺健脾方对TLR4基因过表达后相关蛋白和mRNA的影响，结果显示：与空白对照组相比，CSE 组的TLR4、NF-κB、MUC5AC、MUC7、MUC8蛋白和mRNA的相对表达量增多；与CSE组相比，CSE+含药血清组的TLR4、NFκB、MUC5AC、MUC7、MUC8蛋白和mRNA的相对表达量减少；与CSE+含药血清组相比，CSE+Lv-TLR4+含药血清组的TLR4、NF-κB、MUC5AC、MUC7、MUC8蛋白和mRNA的相对表达量增多，上述差异均有统计学意义（P＜0.01、图6、7）。

图6 各组TLR4、NF-κB、MUC5AC、MUC7、MUC8蛋白平均相对表达量Fig.6 Relative expression of TLR4,NF-κB,MUC5AC,MUC7,and MUC8 proteins in each group.A:Control;B:CSE;C:CSE+YFJP serum;D:CSE+Lv-TLR4-NC;E:CSE+Lv-TLR4;F:CSE+Lv-TLR4+YFJP serum.*P＜0.01 vs A;#P＜0.01 vs B;▲P＜0.01 vs D;▼P＜0.01 vs C.

图7 各组TLR4、NF-κB、MUC5AC、MUC7、MUC8 mRNA相对表达量Fig.7 Relative expression of TLR4,NF-κB,MUC5AC,MUC7,MUC8 mRNA in each group.A:Control;B:CSE;C:CSE+YFJP serum;D:CSE+Lv-TLR4-NC;E:CSE+Lv-TLR4;F:CSE+Lv-TLR4+YFJP serum.*P＜0.01 vs A;#P＜0.01 vs B;▲P＜0.01 vs D;▼P＜0.01 vs C.

2.6 益肺健脾方对TLR4沉默和过表达后TLR4/NF-κB通路炎症因子的影响

通过ELISA法测定益肺健脾方对TLR4基因沉默和过表达后下游炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的影响，结果显示：与空白对照组相比，CSE组的TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8炎症因子水平上升，差异均有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）；与CSE组相比，CSE+含药血清组的TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8炎症因子水平下降，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与CSE+含药血清组相比，CSE+siRNA-TLR4+含药血清组的TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8炎症因子水平下降，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与CSE+siRNA-TLR4组相比，CSE+siRNA-TLR4+含药血清组的TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8炎症因子水平下降，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与CSE+含药血清组相比，CSE+Lv-TLR4+含药血清组的TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8炎症因子水平上升，其中仅TNF-α的差异具有统计学意义（P＜0.05）；与CSE+Lv-TLR4组相比，CSE+Lv-TLR4+含药血清组的TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8炎症因子水平上升，差异均有统计学意义（P＜0.05，图8）。

图8 各组炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的表达量Fig.8 Expressions of TNF-α,IL-1β,IL-6 and IL-8 in each group.A:Control;B:CSE;C:CSE+YFJP serum;D:CSE+siRNA-TLR4-NC or CSE+Lv-TLR4-NC;E:CSE+siRNA or CSE+Lv-TLR4;F:CSE+siRNA-TLR4-NC or CSE+Lv-TLR4+YFJP serum.*P＜0.05,**P＜0.01 vsA,***P＜0.001;#P＜0.01,▲P＜0.05,▲▲P＜0.01 vs B;▼P＜0.05 vs C.

3 讨论

著的减轻COPD气道炎症、抑制气道黏液高分泌的作用［9-11］。在使用CSE对16HBE造模过程中，发现低浓度CSE（5%、10%、15%）作用时间较短时，细胞存活率大于100%，并未发现明显细胞毒性作用，这可能与CSE制备所采用的香烟质量有关，CSE制备所用的雄狮牌香烟价格低廉质量较差，每支焦油含量8 mg，尼古丁含量0.7 mg，烟气一氧化碳含量10 mg，另外CSE的加入在短时间内并不会对16HBE 造成损伤，培养细胞所用的DMEM培养基对细胞生长仍有少量促进作用，这可能是低浓度CSE在短时间内“促进”细胞生长的原因。

对TLR4、NF-κB、MUC5AC、MUC7、MUC8的5个指标的研究发现，益肺健脾方含药血清可降低16HBE COPD 细胞模型TLR4、NF-κB、MUC5AC、MUC7、MUC8的mRNA和蛋白的表达。在TLR4基因沉默后，CSE 诱导的16HBE 中TLR4、NF-κB、MUC5AC、MUC7、MUC8 的mRNA 和蛋白的表达显著降低，而当TLR4基因过表达后，CSE诱导的16HBE中TLR4、NF-κB、MUC5AC、MUC7、MUC8 的mRNA 和蛋白的表达又显著升高，这说明CSE通过TLR4/NF-κB信号通路使16HBE细胞中炎症因子以及黏蛋白分泌增多，该信号通路是CSE诱导16HBE产生炎症和黏液高分泌的关键靶点。TLR4 受LPS 等刺激信号刺激，使用TIR（TIR）结构域的衔接蛋白MyD88［18］，进行一系列磷酸化及泛素化级联活动激活NF-κB，进入核内与DNA特定位点结合，启动其靶基因转录，释放表达炎症细胞因子，进一步诱导黏蛋白MUC过量产生［19］。MUC是具有粘弹性质的复合糖蛋白，其转录产物可通过糖基化的不同翻译修饰后产生多种蛋白质，已知目前被鉴定黏蛋白基因中研究最广泛的是MUC5AC，该基因主要从气道黏膜下腺释放［20］。研究证明MUC5AC是可被诱导产生的，COPD与气道MUC5AC表达增加有关，且MUC5AC的表达与气流阻塞程度相关［21］。而且香烟烟雾刺激可增加COPD气道上皮细胞中TLRs诱导的MUC5AC的产生［22］。此外，NF-κB信号除了上述途径间接刺激黏蛋白分泌，还可直接诱导黏蛋白MUC的产生和合成。研究发现，CSE可促进TLR4表达以及结合LPS的能力，并且促进NF-κB的核移位［23］，这些反应都促使TLR4/NFκB信号通路的激活并向炎症产生以及黏液高分泌的方向转进。而当益肺健脾方含药血清作用于COPD细胞模型后，TLR4、NF-κB、MUC5AC、MUC7、MUC8 的mRNA和蛋白的表达均显著降低，并且能抑制TLR4/NF-κB信号通路的过度激活。这些实验结果均证明益肺健脾方可在细胞水平干预COPD细胞模型，降低黏蛋白的分泌抑制COPD气道炎症和黏液高分泌。

COPD是慢性气道炎性性疾病，作为炎症调控中心的NF-κB及其相关的细胞因子组成的信号网络广泛参与COPD的气道炎症反应过程［24］。一般情况下NF-κB以非活性的形式存在于细胞质中，在多种上游信号分子的作用下可激活NF-κB信号通路。如由Th2 细胞及中性粒细胞释放的TNF-α，与TNF 受体相关因子2（TRAF2）结合，促使IκB 激酶磷酸化IκB［25］，活化后的NF-κB 可加速TNF-α、IL-1β、IL-6 及IL-8 等多种炎症因子的表达，产生粒细胞、巨噬细胞等炎症细胞趋化聚集效应，促使炎症信号效应进一步放大［26］。因此，NF-κB 在COPD气道炎症反应过程中发挥关键作用［27］。慢阻肺的慢性炎症主要累及气道、肺实质和肺血管，其中中性粒细胞、淋巴细胞以及巨噬细胞参与慢性炎症的发生和发展，这些细胞激活后释放包括TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8在内的多种炎症介质［28］。IL-6是引起COPD气道炎症的重要因子之一［29］。它能诱导抗原刺激的T淋巴细胞增殖和B淋巴细胞成熟，使IgE分泌增加，上调局部免疫反应，诱导急性期全身性的反应物释放［30］。IL-8是一种炎性细胞内源性趋化因子，其主要作用是可趋化中性粒细胞，使其变形使细胞内Ca2+浓度升高脱颗粒，使外周血中组胺释放增多而引发炎症反应［31］。本实验通过益肺健脾方含药血清作用于COPD细胞模型后，发现上调的炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8均能降低，这些实验结果证明益肺健脾方可降低炎症指标，缓解COPD炎症。

总之，本实验使用CSE对16HBE细胞进行干预，建立了COPD细胞模型，并使用益肺健脾方可干预COPD细胞模型，通过下调TLR4，从而减少NF-κB转录，抑制MUC产生或合成，降低与NF-κB信号通路相关的炎症因子的表达，抑制了COPD气道炎症和黏液高分泌。证实了TLR4/NF-κB信号通路是益肺健脾方发挥抑制气道炎症和黏液高分泌作用的分子机制和潜在分子靶点之一。