抑制RAB27a能够抑制三阴乳腺癌细胞的增殖、侵袭和粘附

王丽，严志锐，夏耀雄

云南省肿瘤医院//昆明医科大学第三附属医院放射治疗科，云南昆明 650118

三阴性乳腺癌（TNBC）是指雌激素受体、孕激素受体、人类表皮生长因子受体2均为阴性的一类乳腺癌［1］，目前在世界范围内，TNBC呈逐年上升趋势，在所有乳腺癌亚型中占比仅为20%，但占乳腺癌死亡总人数的83%［2］。目前化疗是TNBC患者唯一的选择，不过由于肿瘤异质性和药物耐药性的发展使得TNBC的化疗效果有限［3］。尽管目前在基于肿瘤微环境的靶向治疗上取得许多新的进展［4-7］，但由于肺/骨和脑转移的发生，TNBC仍然具有比较高的发病率和死亡率，更深入地了解肿瘤微环境及其调节因子将有助于设计针对TNBC的免疫靶向治疗方案。已有大量研究证实［8-10］肿瘤微环境的外泌体可以通过将其内容物（如蛋白质、microRNA和长非编码RNA等）在肿瘤细胞之间以及肿瘤细胞和正常细胞之间进行传递，从而对乳腺癌的生长、侵袭及转移进行调控。RAB家族控制了几乎所有的膜转运过程，包括囊泡出芽、外泌体释放以及与受体膜的对接和融合［11］。RAB27家族是RAB家族中的一个亚群，包括RAB27a和RAB27b［12］。之前有研究［13］发现RAB27b能够调节ER阳性乳腺癌细胞系的侵袭、生长和转移，该研究认为通过药理或遗传干预调控RAB27b水平可能对乳腺癌治疗具有巨大的潜力，但该研究并未同时关注与RAB27b具有极高序列相似度的RAB27a是否同样具有巨大的潜力，并且没有仔细探究这种对乳腺癌具有的巨大治疗潜力是否与RAB27家族调控外泌体分泌的能力相关。还有研究［14］分别敲低小鼠乳腺癌细胞中的RAB27a和RAB27b，发现RAB27a才是导致转移性癌（4T1）原发性肿瘤生长和肺扩散的关键，而RAB27b在外泌体的分泌过程中没有起作用，该研究跟ER阳性乳腺癌细胞系的研究并不一致。鉴于在乳腺癌细胞中关于RAB27家族的研究目前刚刚起步，并且其可能是一个具极大潜力的治疗靶点，因此本研究首次使用3株不同的三阴性乳腺癌细胞株作为研究对象，分别抑制这3株不同三阴性乳腺癌细胞株RAB27a和RAB27b的表达，从与RAB27家族密切相关的肿瘤微环境外泌体角度出发，探究RAB27家族的2个成员是否对三阴性乳腺癌细胞的外泌体分泌具有调控作用，并且是否对其生长、侵袭及转移具有重大影响，以期为三阴性乳腺癌的治疗方案提供一个新的方向。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MDA-MB-468、Hs578T 以及正常乳腺上皮细胞系MCF10A 均购自中国科学院昆明动物所细胞库；DMEM高糖培养基、胎牛血清（FBS）及无外泌体血清（Gibco）；脂质体转染试剂、Opti-MEM 培养基、Transwell 小室及本研究中用到的siRNA（Thermo Fisher），哺乳动物活性蛋白抽提试剂、CCK-8试剂盒和BCA蛋白浓度测定试剂盒（江苏碧云天生物技术有限公司），荧光定量分析试剂盒（ABI），RIPA裂解液和吉姆萨染液（北京索莱宝生物科技有限公司），RAB27A、RAB27B、GAPDH蛋白抗体（Abcam），多聚-L-赖氨酸（Merck）。

1.1.2 主要仪器 荧光定量PCR仪（ABI）；化学发光成像仪（Cytiva）；电泳仪（Bio-Rad）；半干转印槽（Bio-Rad）；全自动酶标仪（TECAN）；光学显微镜（奥林巴斯）；二氧化碳细胞培养箱（Thermo）；NanoDrop 2000超微量分光光度计（Thermo）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 MDA-MB-231、MDA-MB-468、Hs578T和MCF10A细胞均使用含10%FBS、1%双抗的DMEM高糖培养基置于37 ℃、5%CO2条件的恒温培养箱中培养，2 d/次换液。进行正式实验前，培养基中的FBS全部更换为无外泌体血清。

1.2.2 qPCR检测细胞中相关基因的表达 提取细胞中的总RNA，参照ABI High capacity cDNA reverse transcription反转录试剂盒进行cDNA的合成。以反转录得到的cDNA为模板，按照ABI公司的荧光定量分析试剂盒（SYBR Select Master Mix）进行实时荧光定量PCR反应。反应体系为：SYBR Premix Ex TaqTMII(2x)10 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 模板2 μL，RNasefree water 6 μL，总体积20 μL。反应结束后，以GAPDH为内参使用2-ΔΔCt法计算目的基因mRNA 相对表达量。内参基因GAPDH和目的基因的引物序列见表1。

1.2.3 Western blot检测细胞中相关蛋白的表达 使用RIPA裂解液提取细胞和组织中的总蛋白，用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测所得总蛋白浓度后，取等量总蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳分离不同大小蛋白，随后把目的蛋白采用半干转膜法转移到PVDF膜上，一抗标记目的蛋白，二抗与一抗结合显色，洗干净后用化学发光成像仪检测蛋白条带，最后用图像分析软件ImageJ对目的蛋白及内参蛋白（GAPDH）条带进行灰度值测试，以目的/内参灰度值比值表示蛋白相对表达量。

外泌体的相对定量测定：收取对数生长期细胞生长状态良好、汇合程度达到70%～80%时的细胞上清液，哺乳动物活性蛋白抽提试剂提取总蛋白，采用上面描述的Western blot方法检测外泌体标志物蛋白含量，内参蛋白（GAPDH）的测定使用培养的细胞按上述检测方法测定，最终以蛋白相对表达量表示各组细胞外泌体的分泌情况。

1.2.4 siRNA转染 按照Lipofectamine RNAi-MAX转染试剂盒说明书的步骤，添加10 nM siRNA转染细胞，24 h后收集细胞检测干扰效率。RAB27AsiRNA的ID号为HSS108985，RAB27B siRNA的ID号为HSS184177，阴性对照NC siRNA 的ID 号为D-001810-10。关于siRNA 的详细信息可通过ID 号登陆https://www.thermofisher.cn/cn/zh/home.html官网网站搜索查询。

1.2.5 细胞增殖、侵袭及粘附实验 待各组细胞生长到对数期后，消化重悬细胞并进行细胞计数。

细胞按104/孔重新铺板于96孔板内，随后每天每孔按100 μL培养基加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育2 h后，酶标仪检测A490nm，持续测定7 d后，以A490nm作图表示各组细胞的增殖情况。

细胞按105/孔重新铺板于提前用Matrigel包被好的Transwell六孔板小室的上室，上室细胞培养基不含血清，下室全部加入含血清培养基，培养24 h后取出上室，用棉签擦拭干净小室内侧所有细胞，并用PBS清洗2～3次。4%多聚甲醛固定小室外侧细胞，吉姆萨染色，200×下拍照并随机计数5个视野内的侵袭细胞，统计各组细胞侵袭能力。

细胞按105/孔重新铺板于用多聚-L-赖氨酸包被好的96孔板内，培养4 h后，分成2组，总细胞组和粘附细胞组，总细胞组直接每孔按100 μL培养基加入10 μL CCK-8溶液，粘附细胞组吸弃含未粘附细胞的原培养基后，用PBS轻柔洗1次，再加入培养基，随后按100 μL培养基加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育2 h后，酶标仪检测A490nm，以粘附细胞组A490nm值/总细胞组A490nm值比值表示细胞粘附率。另外，在各组细胞加入CCK-8前进行拍照，以粘附在板底的细胞量表示各组细胞的粘附情况。

1.3 统计学处理

数据用统计软件SPSS11.5进行分析，两组间差异比较全部采用Student'st检验，所有数据统以均数±标准差表示，结果用软件GraphpadPrism6作图。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RAB27a和RAB27b表达水平以及外泌体鉴定及定量检测

分别对恶性和非恶性乳腺癌细胞株从基因表达水平（图1A）和蛋白表达水平（图1B）进行了检测，发现三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231、MDA-MB-468 和Hs578T中的RAB27a和RAB27b在mRNA和蛋白表达水平均显著高于正常乳腺上皮细胞株MCF10A（P＜0.01）。

图1 恶性和非恶性乳腺细胞株中的RAB27a和RAB27b表达水平Fig.1 Expression levels of RAB27a and RAB27b in 3 triple-negative breast cancer cell lines (MDA-MB-231,MDA-MB-468,and Hs578T) and a normal breast epithelial cell line (MCF10A).A:mRNA expression levels of RAB27a and RAB27b detected by RTPCR.B:Protein expression levels of RAB27a and RAB27b detected by Western blotting.**P＜0.01,***P＜0.001 vs MCF10Agroup.

收集恶性和非恶性乳腺细胞在条件培养基中培养的上清液，以CD9 和MHCII 作为外泌体标记，使用Western blot检测并评估外泌体含量。MDA-MB-231、MDA-MB-468和Hs578T细胞分泌的外泌体含量显著高于MCF10A细胞（P＜0.001，图2）。

图2 恶性和非恶性乳腺细胞株的外泌体鉴定及相对定量分析Fig.2 Identification and quantitative analysis of exosomes in MDA-MB-231,MDA-MB-468,Hs578T and MCF10A cells.***P＜0.001 vs MCF10Agroup.

2.2 抑制RAB27家族对三阴性乳腺癌细胞外泌体分泌的影响

荧光定量PCR 和Western blot 检测siRNA 干预3株恶性乳腺癌细胞株细胞24 h后RAB27a和RAB27b的表达情况，结果显示，我们设计的siRNA-RAB27a和siRNA-RAB27b序列在基因（图3A、B）和蛋白（图3C）表达水平上均能够有效的抑制RAB27a和RAB27b表达。

图3 siRNA的有效性验证Fig.3 Verification of siRNA-mediated RAB27a and RAB27b silencing in the 3 triple-negative breast cancer cell lines.A:Inhibitory effect of siRNA-RAB27a on RAB27a mRNA expression of in the 3 cell lines.B:Inhibitory effect of siRNARAB27b on RAB27b mRNA expression of in the 3 cell lines.C:Inhibitory effect of siRNA-RAB27a and siRNA-RAB27b on RAB27a and RAB27b protein expressions detected by Western blotting.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001 vs control group.

对外泌体含量进行分析（图4），发现抑制RAB27a表达后，MDA-MB-231细胞的外泌体分泌量不论与对照组比还是与siRNA-RAB27b 组比都是显著降低（P＜0.001），但抑制RAB27b表达后，MDA-MB-231细胞的外泌体分泌量跟对照组相比没有明显变化。MDAMB-468细胞抑制RAB27a表达后的情况跟MDA-MB-231细胞类似，但抑制RAB27b表达后，MDA-MB-468细胞的外泌体分泌量显著降低（P＜0.05），不过仍然比siRNA-RAB27a组外泌体分泌量高（P＜0.05）。Hs578T细胞抑制RAB27a和RAB27b的表达后，对外泌体分泌的影响跟MDA-MB-231细胞基本一致。

图4 抑制RAB27a和RAB27b表达后对三阴性乳腺癌细胞外泌体分泌量的影响Fig.4 Effect of RAB27a and RAB27b silencing on exosome secretion in the 3 triple-negative breast cancer cells.*P＜0.05;***P＜0.001 vs control group.

2.3 抑制RAB27家族对三阴性乳腺癌细胞增殖的影响

CCK-8 法检测MDA-MB-231、MDA-MB-468 和Hs578T细胞在RAB27a和RAB27b被抑制后的细胞增殖情况（图5）发现，si-NC组的细胞增殖能力无影响，但抑制RAB27a后其细胞增殖能力严重受影响，而抑制RAB27b后的细胞增殖能力虽然比si-NC组和正常组弱，但仍然强于抑制RAB27a组。该生长曲线图未做统计学比较。

2.4 抑制RAB27家族对三阴性乳腺癌细胞侵袭能力的影响

检测MDA-MB-231、MDA-MB-468和Hs578T细胞在RAB27a和RAB27b被抑制后的细胞侵袭情况发现，si-NC组的细胞侵袭数与对照组比均无统计学差异，si-RAB27a 组的细胞侵袭数与对照组比均显著降低（P＜0.001，图6），si-RAB27b组的细胞侵袭数与对照组比只有MDA-MB-231（P＜0.05）和Hs578T 细胞（P＜0.001）显著降低，MDA-MB-468细胞与对照组比无统计学差异。对比si-RAB27a组与si-RAB27b组发现，三株三阴性乳腺癌细胞的si-RAB27a组细胞侵袭数均显著低于si-RAB27b组（P＜0.05）。

2.5 抑制RAB27家族对三阴性乳腺癌细胞粘附能力的影响

检测MDA-MB-231、MDA-MB-468和Hs578T细胞在RAB27a和RAB27b被抑制后的细胞粘附能力发现，si-NC组的细胞粘附率与对照组比均无统计学差异，三株三阴性乳腺癌细胞si-RAB27a组的细胞粘附率与对照组比均显著降低（P＜0.001，图7），si-RAB27b组的细胞粘附率与对照组比只有MDA-MB-231和MDAMB-468细胞显著降低（P＜0.001），Hs578T细胞与对照组比无统计学差异。对比si-RAB27a组与si-RAB27b组发现，3株三阴性乳腺癌细胞的si-RAB27a组细胞粘附率均显著低于si-RAB27b组（P＜0.001）。

图7 抑制RAB27家族表达对三阴性乳腺癌细胞粘附能力的影响Fig.7 Inhibition of RAB27 family suppresses adhesion of triplenegative breast cancer cells(×100).***P＜0.001 vs control group.

3 讨论

乳腺癌是一种临床异质性疾病，经乳腺切除术、放疗、化疗等治疗后仍然转移能力极强［8］。TNBC具有独特的生物学和临床特征，比其他亚型乳腺癌侵袭性更强、无病生存期更短，同时伴有较高的软组织和内脏转移［15］，并且其5年死亡率高于非TNBC患者［16］。外泌体是40～100 nm大小的细胞外囊泡，它们从多种细胞类型中释放出来，进入细胞外空间，从而将其成分转移到受体细胞中［17,18］，其作为肿瘤微环境的非细胞因素与肿瘤细胞相互作用从而对肿瘤的进一步生长和转移起重要作用［19］。Rab GTPase蛋白家族和Rab效应分子在促进多囊泡胞内体向细胞膜融合和外泌体向细胞外空间释放方面发挥核心作用，其中Rab27a和Rab27b与外泌体的释放密切相关。最初关于Rab27a的研究比较广泛，Rab27b的研究相对较少［20］，因为它们在氨基酸序列上具有高达71%的同源性［21］，不仅如此，它们还有许多共同的效应因子，被认为在分泌通路中的调节作用是一致的［22］。然而，最近的证据表明Rab27a和Rab27b也通过与不同的Rab27效应因子相互作用发挥不同的作用，Rab27a可能是多囊泡胞内体与质膜对接和融合所必需的，而Rab27b可能连接多囊泡胞内体与向外定向的马达蛋白［23］。目前已有部分研究试图通过靶向RAB27家族抑制肿瘤的生长、侵袭及转移［24,25］，但RAB27a 和RAB27b在不同癌症中起到的具体作用尚不清楚。

本研究先检测了正常乳腺上皮细胞株和3株三阴性乳腺癌细胞株发现，3株三阴性乳腺癌细胞株的外泌体分泌量显著高于正常乳腺上皮，且Rab27a和Rab27b的表达也显著高于正常乳腺上皮。随后通过采用siRNA分别干扰Rab27a和Rab27b在三阴性乳腺癌细胞株中的表达发现，抑制Rab27a表达后显著的降低了三阴性乳腺癌细胞的外泌体分泌。与文献报道的敲低Rab27a后恶性乳腺癌细胞中外泌体分泌量降低的结果一致［24］。但是，抑制Rab27b表达后三阴性乳腺癌细胞外泌体的分泌量没有受到太大的影响，虽然跟我们的预期不一致，但也有对人肾癌细胞株A498的研究发现采用si-RNA抑制Rab27b表达后其外泌体数量与对照组相比无统计学差异［26］，因此我们推测Rab27b在三阴性乳腺癌中可能与外泌体的分泌无关。随后进一步检测Rab27a和Rab27b被抑制后三阴性乳腺癌细胞的一些细胞生物学功能的变化发现，Rab27a被抑制后能够显著的影响三阴性乳腺癌细胞的增殖能力、侵袭能力以及粘附能力，结合本研究中发现的抑制Rab27a后对三阴性乳腺癌细胞外泌体释放的抑制作用，以及其他研究对肿瘤外泌体的发现，即肿瘤外泌体中包含致癌蛋白［27］、RNA片段［28］、突变的DNA片段［29］和信号分子［30］等，它们不仅可在肿瘤微环境中发生各类信号交流并可在功能上转移到肿瘤微环境内的非癌细胞中从而支持肿瘤的生长、侵袭和转移［31］，本研究认为Rab27a在TNBC中所发挥的作用可能是依靠促进癌细胞外泌体分泌而造成的。而Rab27b被抑制后虽然能够影响三阴性乳腺癌细胞的增殖能力、侵袭能力以及粘附能力，但显然不及抑制Rab27a对三阴性乳腺癌细胞生物学功能造成的影响。所以，我们认为Rab27b被抑制后对癌细胞的影响并不是通过外泌体造成，有对肾癌细胞的RNA序列和信号通路分析提示RAB27b在癌症中的促进作用可能与MAPK 和VEGF 信号通路有关［26］，还有研究指出Rab27b可能通过刺激HSP90α蛋白的分泌从而促进肿瘤的侵袭［13］，甚至有研究提出Rab27b能够与耐药蛋白相互作用从而提高肿瘤细胞的耐药性［32］，因此，关于Rab27b在TNBC中的作用和具体的分子机制可能还需要进一步的研究来阐明。另外，就像Rab27b暗示的，Rab27家族在未来的研究中除了关注其对外泌体分泌的重要作用外，可能还有其他影响的信号通路或分子。

综上所述，本研究通过对三阴性乳腺癌细胞株中外泌体的分泌以及使用siRNA抑制Rab27a和Rab27b后对癌细胞生物学功能的检测发现，三阴性乳腺癌细胞的外泌体分泌量相比正常乳腺上皮细胞显著提升，Rab27家族中在三阴性乳腺癌细胞外泌体分泌过程中起核心作用的是RAB27a，抑制RAB27a能够更加显著的抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖、侵袭和粘附，未来进一步利用Rab27a作为靶标对于TNBC的治疗可能具有广阔的应用前景。