Akt22 抑制剂促进大鼠根尖周炎症微环境中巨噬细胞的极化：基于降低miR-155-5p的表达

李敬怡，杨思圆，韩振，江天乐，朱耀，周子航，周静萍

皖南医学院口腔医学院//皖南医学院口腔疾病研究中心，安徽芜湖 241000

根尖周炎是一种常见的口腔疾病，由病原体引起的根尖周围组织的炎症和牙槽骨破坏，多继发于牙髓腔内的感染［1-3］。口腔微环境和根尖周炎微生物的复杂多样性导致根尖周炎的致病机制尚未明确，是目前研究的热点。

巨噬细胞大多来源于单核细胞，能够识别、吞噬和溶解杀伤感染的病原微生物及凋亡的细胞［4］。巨噬细胞可以在不同致病因素的刺激下极化为经典活化巨噬细胞（M1型，CD86+细胞）和替代性活化巨噬细胞（M2型，CD163+细胞），其中M1型能够产生促炎介质（如IL-6），加重炎症反应，而M2型能够释放抗炎介质（如IL-10），促进组织修复反应［5-7］。近年研究发现根尖周炎中巨噬细胞的极化可能影响根尖周炎的进展［8-12］，但是巨噬细胞在根尖周炎症微环境中的极化是被如何调控的尚不清楚。

酰肌醇3激酶/丝氨酸/苏氨酸激酶（PI3K/Akt）信号通路是生物体内重要的参与多种细胞生命活动的信号转导通路，该通路在细胞增殖分化、自噬凋亡、炎症调控、肿瘤生长侵袭等过程中发挥重要作用［13,14］。研究表明，PI3K/Akt信号通路参与骨关节炎、骨性肿瘤、牙周炎等骨相关性疾病进展［15-18］，调节破骨细胞和成骨细胞的增殖、分化及凋亡［19-22］。Akt2是PI3K/Akt信号通路中激活蛋白激酶Akt的一个重要亚型［23］，Akt2的缺失可阻止巨噬细胞发生M1型极化，促进M2型巨噬细胞的形成［24-26］，并且促进巨噬细胞表达低水平的TNF-α和IL-6以及高水平的炎症区域分子1（Fizz1）和IL-10［24,26］。miR-155是microRNA的一种，其通过PI3K/Akt信号通路可影响牙周炎、骨关节炎的发生发展［27,28］。研究发现miR-155受到异常调控后可以诱导巨噬细胞向M1型或M2型巨噬细胞极化［29-33］。Akt 信号通路中转录因子C/EBPβ是miR-155的靶点之一，与调控巨噬细胞极化密切相关［34］，其表达水平与miR-155呈负相关［35］。有学者在研究PI3K/Akt信号通路中发现，Akt2沉默后miR-155表达水平受到抑制，C/EBPβ表达水平上调，并调控M2型巨噬细胞标志物（Arg1）的表达［36］。

目前，Akt2抑制剂在实验研究中应用广泛，已有很多Akt小分子抑制剂进入临床开发阶段。哌立福新是一种Akt抑制剂，研究发现它通过Akt信号通路抑制了神经炎症中小胶质细胞自噬［37］。MK-2206对Akt的不同亚型有一定的选择性抑制。有实验应用MK-2206研究小鼠内毒素血症的炎症反应与Akt 信号通路的关系［38］。在本次研究中，我们使用Akt2 抑制剂进行实验。实验使用的CCT128930是一种有效的选择性Akt2抑制剂。有研究发现CCT128930的浓度为100 μmol/L时可抑制大鼠牙周炎症发展［18］。

本实验拟在构建慢性根尖周炎模型的过程中加入Akt2抑制剂，通过影像学检查了解根尖周组织的骨质破坏、IHC 和RT-PCR 检测Akt2、巨噬细胞标记物（CD86、CD163）、炎症介质（IL-6、IL-10）、miR-155-5p、C/EBPβ的表达,探讨抑制Akt2对根尖周炎症微环境中巨噬细胞极化的影响，分析Akt2抑制后miR-155-5p表达水平和巨噬细胞极化的关系，为慢性根尖周炎致病机制的研究提供一些实验基础。

1 材料和方法

1.1 实验动物

本实验选用10周龄雄性SPF级SD大鼠32只（天勤生物技术有限公司，长沙），体质量280～320 g。SPF级动物房饲养。

1.2 主要试剂

戊巴比妥钠（源叶生物科技有限公司）；CCT128930（APExBIO）；Akt2、CB86、CD163、IL-6、IL-10抗体（塞维尔生物科技有限公司）；免疫组化试剂套装（塞维尔生物科技有限公司）；逆转录试剂盒（Thermo）；SuperReal PreMix Plus RT-PCR 试剂盒、miRcute 增强型miRNA cDNA第一链合成试剂盒、miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒（天根生化科技有限公司）

1.3 实验方法

1.3.1 构建大鼠慢性根尖周炎模型 动物实验经皖南医学院伦理委员会审查批准。将32只10周龄雄性SD大鼠按随机数字表法分为5组，其中4只作为健康对照组，其余28只作为实验组，实验组大鼠经腹腔注射1%戊巴比妥钠（30 mg/kg，源叶生物）全麻，使用移动式牙科综合治疗机（DU892，岱洛），用1/4号金刚砂球钻（德睿邦）打开双侧下颌第1 磨牙髓腔，去除冠髓，用#6K 锉（MANI，东京，日本）疏通根管，将髓腔暴露于口腔中，常规饲养。Akt2抑制剂组每2 d在右侧下颌第一磨牙根管内注射Akt2抑制剂CCT128930（100 μmol/L，5 μL）。生理盐水组在左侧下颌第一磨牙根管内注射等量生理盐水。于开髓后第7、14、21、28天通过注射过量戊巴比妥钠随机处死7只实验组大鼠及1只健康对照组大鼠，分离并收集双侧下颌骨，用于影像学检查、苏木精-伊红染色、免疫组化染色和RT-PCR反应。

1.3.2 大鼠根尖周组织样本收集 SD大鼠安乐死后，分离两侧下颌骨，在冰上置有生理盐水的培养皿中用无菌刀片剥离附着在两侧下颌骨上的软组织。将干净的下颌骨快速行X线拍照处理后，一部分下颌骨放入4%组织细胞固定液中固定24 h，用于HE和IHC染色。另一部分下颌骨用解剖刀、剪刀及钳子获取根尖周病损组织和健康的根尖周组织，放入-80 ℃超低温冰箱保存备用，用于RT-PCR反应。

1.3.3 影像学检查 采用移动式牙科X射线机（HQY-G，海清，青岛，中国）观察根尖周病变范围，曝光时间为0.01 s。所获得的图像使用简单观察器软件进行观察。

1.3.4 HE染色 石蜡切片脱脂及水化，与苏木精溶液（Servicebio）和伊红溶液（Servicebio）染色5 min。经乙醇脱水，脱色，二甲苯渗透，中性树胶（国药集团化学试剂有限公司）封片。在光学显微镜（Nikon Eclipse E100）下观察第一磨牙根尖周组织的炎症浸润。

1.3.5 免疫组化染色 常规石蜡包埋福尔马林固定24 h以上的标本，将蜡块连续切片（3～5 μm），37 ℃水浴中展片，防脱玻片捞取，65 ℃烤箱中烘烤1 h；依次将切片放在二甲苯、无水乙醇中，各3 min×2次进行脱蜡，随后依次放入95%、80%、70%乙醇中各3 min；PBS冲洗切片2 min×3次，3%双氧水中孵育10 min，以消除内源性过氧化物酶活性，浸入枸橼酸缓冲液（pH 6.0）中，微波炉内加热95 ℃以上持续10 min，室温冷却20 min，滴加山羊血清封闭液，37 ℃孵育15 min；滴加相应一抗（1∶200）4 ℃孵育过夜；PBS冲洗2 min×3次，滴加适量二抗（1∶100），37 ℃孵育20 min，滴加适量辣根酶标记的链霉卵白素工作液，37 ℃孵育30 min；PBS冲洗后DAB显色5 min，自来水冲洗20 min；苏木精中复染细胞核3 min，自来水冲洗10 min；浸入1%盐酸乙醇中分化30 s，自来水冲洗3 min以返蓝；依次置入70%、80%、95%乙醇中各1 min，侵入无水乙醇2 min×2次，最后置于二甲苯2 min×3次以脱水；滴加适量中性树胶，用盖玻片覆盖封片。在光学显微镜（Nikon Eclipse E100）下观察第一磨牙根尖周区Akt2、CD86、CD163、IL-6、IL-10的染色情况。每个样本拍3张根尖周区域照片（400倍镜），视野选择随机、不重叠，阳性细胞分布均匀。阳性判断标准为界限清楚，突出于背景的淡黄色、棕黄色或棕褐色颗粒。使用Image J软件计算每张图片的阳性细胞数，最后求平均数即为该免疫组化切片阳性细胞数。

1.3.6 RT-PCR 采用TRIzol法提取下颌第1磨牙根尖周组织，使用逆转录试剂盒（Thermo，）和miRcute增强型miRNA cDNA第一链合成试剂盒（天根）进行扩增，扩增过程采用PCR基因扩增仪MJMini（BIO-RAD）进行。使用SuperReal PreMix Plus RT-PCR 试剂盒（天根）和miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒（天根）测定了不同的分子，测定过程采用实时定量PCR仪QuantStudio3（Thermo）进行。根据2-△△Ct的公式分析不同mRNA的相对水平（表1）。

表1 本研究所使用的引物序列Tab.1 Primer sequence used in this study

1.3.7 统计学分析所有实验都经过3次或者3次以上的重复实验。数据表示为均数±标准差。使用GraphPad prism 8.0进行统计分析。实验符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用两独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠慢性根尖周炎模型构建成功

大鼠根尖周影像学检查结果显示，与健康对照组相比，髓腔开放21 d后大鼠下颌第一磨牙根尖透射区范围增大明显（图1A），与生理盐水组（图1B）相比，Akt2抑制剂组（图1C）大鼠根尖周透射区范围都有明显减小。苏木精-伊红染色结果显示，健康对照组大鼠根尖周牙周膜中可见少量炎症细胞，实验组大鼠根尖周组织炎症细胞浸润范围明显增大，牙槽骨出现吸收破坏（图1D）。Akt2抑制剂组（图1F）大鼠根尖周炎性细胞浸润程度以及骨质破坏范围都明显低于生理盐水组（图1E）。

图1 大鼠根尖周组织骨质破坏及炎症浸润情况Fig.1 X-ray imaging and HE staining of the periapical tissues of the rats in each group.A-C:X-ray imaging in healthy control group,normal saline group and Akt2 inhibition group,respectively(the transmission area is the bone destruction area).D-F:HE staining in healthy control group,normal saline group andAkt2 inhibition group,respectively(Original magnification:×100).

2.2 免疫组化实验结果

2.2.1 Akt2、CD86、CD163在大鼠根尖周组织中的表达Akt2、CD86、CD163 阳性细胞呈棕褐色，均为胞浆着色。免疫组化染色结果显示，健康对照组（图2A）大鼠根尖周组织中有少量Akt2阳性细胞表达。髓腔开放21 d后，实验组大鼠根尖周组织中Akt2阳性细胞表达明显增多；Akt2抑制剂组（图2C）Akt2阳性细胞表达均少于生理盐水组（图2B），统计学结果显示两组差异均具有统计学意义（P＜0.05，图5A）。

图2 Akt2蛋白在大鼠根尖周组织中的表达情况Fig.2 Immunohistochemical staining for detecting Akt2 protein expression in the periapical tissues in healthy control group (A),normal saline group(B)and Akt2 inhibition group(C).The positive particles are located in the cytoplasm and appear brown-yellow as indicated by arrows(×100 or×400).

免疫组化结果显示，与健康对照组（图3A、图4A）相比，髓腔开放21 d后，实验组（图3B）大鼠根尖周组织中CD86阳性细胞表达明显增多，CD163阳性细胞表达明显增多（图4B）。Akt2抑制剂组（图3C）CD86阳性细胞表达少于生理盐水组（图3B），抑制剂组（图4C）CD163阳性细胞表达均多于生理盐水组（图4B）统计学结果显示差异均具有统计学意义（P＜0.05，图5B、C）。

图4 CD163蛋白在大鼠根尖周组织中的表达情况Fig.4 Immunohistochemical staining for detecting CD163 protein-labeled M2 macrophages in the periapical tissues ofhealthy control group (A),normal saline group (B) and Akt2 inhibition group (C).The positive particles are located in the cytoplasm and appear brownish yellow as indicated by arrows(×100 or×400).

计算M1型/M2型巨噬细胞数的比值。髓腔开放21 d后，Akt2抑制剂组CD86+M1型/CD163+M2型巨噬细胞的比值低于生理盐水组CD86+M1型/CD163+M2型巨噬细胞的比值，统计学结果显示差异具有统计学意义（P＜0.05，图5D）。

图5 大鼠根尖周组织中Akt2、CD86和CD163阳性细胞数及CD86+/CD163+的比Fig.5 Numbers of cells positive for Akt2(A),CD86(B)and CD163(C)and CD86+/CD163+cell ratio(D)in the periapical tissue of the rats.CD86 labeled M1 macrophages and CD163 labeled M2 macrophages.*P＜0.05;**P ＜0.01;***P＜0.001;****P＜0.0001.

2.2.2 炎症介质IL-6、IL-10在大鼠根尖周组织中的表达免疫组化结果显示，与健康对照组（图6A、E）相比，髓腔开放21 d 实验组（图6B、C、F、G）大鼠根尖周组织中IL-6、IL-10阳性细胞表达都明显增多，说明大鼠根尖周组织中IL-6、IL-10的表达升高。Akt2抑制剂组（图6C）IL-6阳性细胞表达低于生理盐水组（图6B），抑制剂组（图6G）大鼠根尖周组织中IL-10阳性细胞表达高于生理盐水组（图6F），统计学结果显示差异均具有统计学意义（P＜0.05，图6D、H）。

图6 IL-6、IL-10蛋白在大鼠根尖周组织中的表达情况Fig.6 Expression of IL-6 and IL-10 protein in periapical tissue of rats.A-C:Immunohistochemical staining for IL-6 in the periapical tissues of healthy control group,normal saline group and Akt2 inhibition group,respectively (×400).E-G:Immunohistochemical staining for IL-10 in the periapical tissues of healthy control group,normal saline group and Akt2 inhibition group,respectively(×400).The positive particles are located in the cytoplasm and appear brownish yellow as indicated by arrows.D:Statistical analysis of the number of IL-6-positive cells in each group.H:Statistical analysis of the number of IL-10-positive cells in each group.*P＜0.05;**P＜0.01

2.2.3 逆转录-聚合酶链反应结果 逆转录聚合酶链反应结果显示，与生理盐水组相比，髓腔开放21 d时，Akt2抑制剂组大鼠根尖周炎组织中Akt2、CD86、miR-155-5p和IL-6的mRNA相对表达量明显降低，CD163、C/EBPβ和IL-10的mRNA相对表达量明显增高，统计学结果显示两组差异均具有统计学意义（P＜0.05，图7）。

图7 大鼠根尖周组织中Akt2、CD86、CD163、miR-155-5p、C/EBPβ、IL-6和IL-10 mRNA的相对表达量Fig.7 Relative mRNA expression levels of Akt2,CD86,CD163,Mir-155-5p,C/EBPβ,IL-6 and IL-10 in the periapical tissues of the rats.CD86 labeled M1 macrophages and CD163 labeled M2 macrophages.*P＜0.05;**P＜0.01;***P＜0.001;****P＜0.0001.

3 讨论

根尖周组织炎性微环境中细胞、细胞因子和其他炎性因素之间有着非常复杂相互作用关系，可以保护根尖周组织，也可以导致根尖周组织严重破坏［39］。本实验通过应用Akt2抑制剂作用于大鼠根尖周组织，研究根尖周炎症微环境中巨噬细胞的表达及其与miR-155-5p、C/EBPβ因子的相关性，探讨抑制Akt2对巨噬细胞极化的影响及相关因素。

3.1 抑制Akt2可减缓大鼠慢性根尖周炎症进展

有文献报道Akt在小鼠根尖周炎中表达增高，并且与破骨细胞在根尖周炎中的表达趋势一致［40］。在本研究中，我们成功建立大鼠慢性根尖周炎模型［41］，基于此我们发现健康对照组大鼠根尖周组织中Akt2表达很少，而在根尖周炎症组织中Akt2呈高表达状态。另外与生理盐水组相比，Akt2抑制剂组大鼠根尖周组织中Akt2的表达量明显降低，根尖周骨质破坏面积明显缩小，炎症细胞浸润程度明显减轻。由此我们可以推断Akt2在根尖周炎组织中呈高表达状态，扮演着促进炎症进展的角色。抑制Akt2高表达可能减缓大鼠根尖周炎症进展，促进组织修复反应。

3.2 抑制Akt2 可促进大鼠根尖周炎症中巨噬细胞向M2型极化

巨噬细胞参与调控机体炎症、修复、肿瘤发生等生理和病理过程，可极化为M1型和M2型巨噬细胞。Akt亚型的特定功能与巨噬细胞极化存在密切的联系［42］。研究发现，Akt2能够影响结肠炎、腹膜炎等炎症性疾病中巨噬细胞的极化从而影响炎症进展［26,43］。但目前尚未有学者研究Akt2在根尖周炎症中对巨噬细胞极化影响。我们在本实验中比较了髓腔开放21天后生理盐水组和Akt2抑制剂组大鼠根尖周炎中M1型巨噬细胞标记物CD86和M2型巨噬细胞标记物CD163的表达情况。研究发现与生理盐水组相比较，Akt2 抑制剂组CD86+细胞在根尖周炎症中明显降低，而CD163+细胞表达量增高，CD86+/CD163+细胞的比值明显降低，并且主要由M1型巨噬细胞分泌，参与促炎状态，刺激骨质吸收破坏的重要因子IL-6表达量也明显降低；而主要由M2型巨噬细胞分泌，参与免疫调节状态，促进组织修复反应，可促进成骨细胞分化，抑制骨吸收的因子IL-10表达量明显增高［44-46］。这说明抑制Akt2的表达降低了大鼠根尖周炎症组织中M1型巨噬细胞表达，促进M2型巨噬细胞的表达，促进巨噬细胞极化向M2型倾斜。

3.3 应用Akt2抑制剂后，miR-155-5p与巨噬细胞极化之间的关系

miR-155是microRNA的其中一种，可与目标基因mRNA 3'-非编码区结合从而抑制其表达，与炎症的发生发展和免疫系统的调节密切相关［47］，是调控巨噬细胞极化的microRNA之一［48］。Akt信号通路中转录因子C/EBPβ是miR-155的靶点之一，C/EBPβ在调控巨噬细胞极化中起基础性作用［34］。本研究发现，miR-155-5p在健康对照组中的表达水平很低，在大鼠根尖周炎症组织中呈高表达。注射Akt2 抑制剂后，根尖周炎症组织中miR-155-5p表达明显降低，而C/EBPβ表达水平的升高，并与CD86+、CD163+细胞表达呈现明显相关性，据此我们推测miR-155-5p可能通过Akt2信号通路参与调控大鼠根尖周炎巨噬细胞极化，Akt2抑制剂可能部分阻断了Akt信号通路导致miR-155-5p表达降低，激活C/EBPβ，从而调控巨噬细胞向M2型极化。

综上所述，本研究表明Akt2在大鼠根尖周炎症时呈高表达状态，促进炎症进展。抑制Akt2在大鼠根尖周组织中的表达可以促进巨噬细胞极化向M2型倾斜，促进抗炎介质的分泌，减缓炎症进展，促进组织修复反应。而miR-155-5p可能是Akt2调控巨噬细胞极化的关键靶点，Akt2抑制剂可能通过降低miR-155-5p的表达影响巨噬细胞极化。本实验研究结果有助于我们更深层次理解根尖周炎的发病机制，为研究Akt信号通路与根尖周炎致病机制的关系提供了新方向。