槲皮素降低邻苯二甲酸酯类混合物暴露致大鼠睾丸组织的氧化损伤的机制

刘丽兰，邓儒雅，周稳进，林敏，夏玲姿，高海涛

温州医科大学1公共卫生与管理学院预防医学系，2浙江省流域水环境与健康风险研究重点实验室，浙江温州 325035

世界上约15%的育龄夫妇罹患不孕不育症，其中男性因素约占50%，而精子质量下降是导致男性不育的关键因素［1］。人群资料显示，精子质量与邻苯二甲酸酯类（PEs）暴露水平呈负相关［2］。全球PEs年产量超过200万吨，其中邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）、邻苯二甲酸丁苄酯（BBP）和邻苯二甲酸二丁酯（DBP）在塑料工业中的应用最广泛［3,4］。PEs及其代谢物可在人精液、尿液中检出，其中，DEHP、BBP和DBP及其代谢物的检出率居高［5,6］。PEs作为环境内分泌干扰物具有睾丸毒性，可导致生殖系统相关疾病［7］。由于PEs暴露的潜在危害，美国国家环保署将DBP、BBP、DEHP等列为环境优先控制污染物［8］。

PEs暴露可诱导氧化应激，导致睾丸组织氧化损伤，降低精子活力，减少精子数量等［9,10］。Nrf2是调控抗氧化应激的关键转录因子，氧化应激可激活Nrf2信号通路，诱导抗氧化酶的生成，如血红素加氧酶1（HO-1）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）等，以清除自由基，降低氧化应激［11-13］。研究表明，PEs 暴露可上调睾丸Nrf2，促进抗氧化酶HO-1、SOD等表达［14］。人群不可避免的暴露于PEs混合物，面临氧化损伤风险；开展PEs氧化损伤的抑制作用研究，对维护人群健康具有重要意义。

黄酮类化合物槲皮素（Que）具有很强的抗氧化作用，可保护机体组织免受自由基介导的氧化损伤［15］。据报道，Que可螯合小鼠体内金属离子（如Fe2+），降低酒精对肝的氧化损伤［16］；Que可调节大鼠心肌组织、肝组织、肾、胰腺组织及小鼠脑组织中抗氧化酶活性，减缓机体的氧化应激过程［16-18］；Que还可直接清除自由基，降低二嗪农、丙卡巴嗪诱导的大鼠肝组织和脑组织氧化损伤［19,20］。

Nrf2在Que抑制组织氧化损伤中起重要作用［21］，而Que通过Nrf2信号通路调控组织防御氧化损伤机制存有争议。研究表明，Que作为强抗氧化剂可直接清除自由基，减缓氧化应激对Nrf2的诱导作用，恢复体内抗氧化酶水平［22］；另有研究显示，Que通过上调Nrf2，促进抗氧化酶表达以清除自由基，降低氧化应激［23］。这提示Que抑制组织氧化损伤的作用机制需要进一步研究。此外，人群暴露于PEs混合物，而目前关于PEs的毒作用研究主要集中于单一PEs暴露，尚不能模拟人群PEs混合物暴露的实际特征［8］。因此，本研究模拟人群PEs混合物暴露的实际特征，探讨了Que对BBP，DBP和DEHP 3种PEs混合物暴露所诱导的睾丸氧化损伤的抑制作用和机制，为降低PEs的健康风险提供一些基础资料。

1 材料和方法

1.1 试剂与仪器

BBP、DBP、DEHP、Que（阿拉丁）；大鼠睾酮、促黄体生成素（LH）、卵泡刺激素（FSH）ELISA试剂盒（南京迈博生物）；牛血清白蛋白BSA-V（索莱宝）；丙二醛（MDA）、SOD、CAT检测试剂盒，苏木素伊红（H&E）染色试剂盒，RIPA细胞裂解液，BCA蛋白浓度测定试剂盒，PVDF膜，抗体Nrf2、Keap1、HO-1和β-Actin，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（H+L），Alexa Fluor 488标记山羊抗兔IgG（H+L），DAPI染色液，抗荧光猝灭封片液，特超敏ECL 化学发光试剂盒等均购自碧云天。Centrifuge 5417R离心机（Sigma）；电泳仪、电泳槽、转膜仪、ChemiDoc XRS+发光成像系统曝光机（Bio-Rad）。MPEs为BBP、DBP、DEHP的等毒性混合物，即根据其参考剂量，设定BBP：DBP：DEHP=10:5:1［24］。

1.2 动物分组与处理

40只雄性SD大鼠（80～120 g）购于浙江维通利华实验动物技术有限公司（许可证号：SCXK（浙）2019-0001），SPF级屏障系统适应1周后，根据体质量将40只雄性SD 大鼠随机分为5 组：对照组，MPEs 暴露组（MPEs），MPEs联合低、中、高剂量Que干预组（MPEs+L-Que、MPEs+M-Que、MPEs+H-Que）。MPEs组大鼠灌胃900 mg/（kg·d）MPEs，MPEs 联合低、中、高剂量Que干预组大鼠灌胃900 mg/（kg·d）MPEs及10、30、90 mg/（kg·d）Que，对照组大鼠灌胃等剂量的赋形剂（0.5%羧甲基纤维素钠）；1次/d，连续灌胃30 d；第31天腹腔麻醉后，大鼠尾静脉取血，分离血清；处死，测肛殖距，解剖，取睾丸和附睾，称重；根据公式：脏器系数=脏器质量（g）/大鼠体质量（g）×100；取适量睾丸组织于10%中性福尔马林液固定，另取适量睾丸组织，液氮冻存，备用。本研究动物实验经温州医科大学实验动物伦理委员会批准（批准号：wydw2019-0050）。

1.3 血清性激素水平测定

大鼠ELISA试剂盒测定血清中睾酮、LH、FSH水平，每个样品测两个平行，严格按照试剂盒的使用说明进行操作。

1.4 睾丸组织病理学观察

取10%中性福尔马林液固定的睾丸组织，二甲苯透明、梯度乙醇脱水、石蜡包埋，切片（4 μm厚），37 ℃烘箱烘干；二甲苯、梯度乙醇、蒸馏水脱蜡复水；用苏木精染色15 min；盐酸乙醇溶液分色3 s；自来水返蓝5 min；伊红染色10 min。中性树胶封固后，显微镜观察。

1.5 睾丸组织氧化应激指标水平测定

称取50 mg睾丸组织，加入800 μL裂解液进行组织匀浆，14 000g离心15 min，取上清，BCA蛋白定量；试剂盒测定睾丸组织中MDA、SOD、CAT等抗氧化酶水平，严格按照试剂盒的使用说明进行测定。

1.6 Western blot检测睾丸组织Nrf2、Keap1和HO-1蛋白表达

称取50～70 mg 睾丸组织，加入适量的裂解液（RIPA裂解液:PMSF=100∶1）进行组织匀浆，14 000g离心15 min，取上清，BCA 蛋白定量；加入5×Loading buffer煮沸20 min，SDS-PAGE电泳和转膜；5%脱脂奶粉封闭2 h；洗膜，一抗孵育（Nrf2 1∶1000、Keap1 1∶1000和HO-1 1∶1000、β-Actin 1∶1000），4 ℃过夜；再次洗膜，二抗孵育（1∶1000），室温2 h；洗膜，ECL化学发光凝胶成像显影。Image J软件检测目的蛋白（Nrf2、Keap1和HO-1）条带和β-Actin条带的灰度值（A），以A目的蛋白/Aβ-actin表示目的蛋白表达量。

1.7 免疫荧光染色检测睾丸组织中Nrf2、Keap1蛋白的表达水平

取睾丸石蜡切片置于65 ℃烘箱烘烤2 h，二甲苯和梯度乙醇、蒸馏水进行脱蜡复水；柠檬酸钠缓冲液（pH 6.0）抗原修复95 ℃15 min；0.3%曲拉通透膜15 min；PBS洗片后，10%的牛血清室温封闭60 min；一抗（Nrf2 1∶250、Keap1 1∶250）4 ℃孵育过夜。37 ℃烘箱复温30 min；PBS洗片后，荧光二抗（1∶500）室温避光孵育1 h，滴加DAPI避光染色10 min，使用抗荧光淬灭封片剂进行封片，荧光显微镜（莱卡DM4000 B LED）显微镜下观察采集图像。

1.8 统计学分析

采用Graph Pad Prism 8软件进行统计学分析。计量资料均以均数±标准差表示，组间数据差异的比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠睾丸及附睾脏器系数

与对照组相比，MPEs组大鼠肛殖距、睾丸与附睾质量及其脏器系数均降低（P＜0.05）；与MPEs组相比，MPEs+H-Que组大鼠睾丸与附睾质量及其脏器系数均升高（P＜0.05，表1）。

表1 大鼠体质量、肛殖距及睾丸、附睾质量Tab.1 Body weight,anogenital distance,weight and coefficients of the testis and epididymis of the rats(Mean±SD,n=8)

2.2 大鼠血清性激素水平

与对照组相比，MPEs组大鼠血清睾酮、LH、FSH含量降低（P＜0.01）；与MPEs组相比，MPEs+L-Que组和MPEs+M-Que组大鼠血清睾酮、LH、FSH水平均有升高趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05），而MPEs+H-Que组大鼠血清睾酮、LH、FSH水平均升高（P＜0.05，表2）。

表2 大鼠血清性激素水平Tab.2 Serum sex hormone levels in the rats in different groups(Mean±SD,n=8)

2.3 睾丸组织病理结构

MPEs组大鼠睾丸组织形态较对照组明显萎缩，变小；而MPEs+M-Que组和MPEs+H-Que组大鼠睾丸形态较MPEs组明显变大，趋于正常（图1）。

图1 睾丸形态Fig.1 Testicular morphology in different groups.A:Control group.B:MPEs group.C:MPEs+L-Que group.D:MPEs+M-Que group.E:MPEs+H-Que group.

对照组大鼠睾丸曲细精管结构完整，呈圆形或卵圆形，生精细胞与基底膜紧密结合，管腔内生精细胞排列有序、层次分明，从基底膜至管腔依次为精原细胞、精母细胞、精细胞、精子，无损伤（图2A）。MPEs组大鼠曲细精管明显萎缩，精细胞明显减少（仅1层），个别曲细精管破损，管腔内几乎无精细胞；睾丸间质细胞增生，间质内有大量脂滴存在（图2B）。MPEs+L-Que组大鼠曲细精管亦明显萎缩，精细胞减少（1～3层），睾丸间质细胞增生，间质内有诸多脂滴存在（图2C）。MPEs+M-Que组大鼠睾丸曲细精管稍有萎缩，管腔内可看到2～4层精细胞，亦有睾丸间质细胞增生，间质内有微量脂滴存在（图2D）。MPEs+H-Que组大鼠睾丸曲细精管亦稍有萎缩，曲细精管内可见3层以上精细胞；5只大鼠睾丸间质细胞增生（图2E1，E2）；3只大鼠睾丸组织各级生精细胞有序排列，管腔内有大量成熟精子（图2E3）。

图2 睾丸组织病理结构Fig.2 Histopathological structure of the testes in different groups.A:Control group.B:MPEs group.C:MPEs+L-Que group.D:MPEs+MQue group.E:MPEs+H-Que group.ST:Seminiferous tubule;PS:Primary spermatocyte;SC:Secondary spermatocyte;SZ:Spermatocyte;LC:Leydig cells;LD:Lipid droplet.

2.4 睾丸组织MDA、SOD和CAT水平

与对照组相比，MPEs组MDA、SOD、CAT水平升高（P＜0.01）；与MPEs 组相比，MPEs+M-Que 组和MPEs+H-Que组睾丸组织中的MDA、SOD、CAT水平降低（P＜0.01），MPEs+L-Que组睾丸组织中的CAT水平亦降低（P＜0.05）；MPEs+L-Que组睾丸组织中MDA、SOD水平较MPEs组有降低趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05，图3）。

图3 睾丸组织MDA、SOD和CAT水平Fig.3 Expression levels of testicular MDA(A),SOD(B)and CAT(C)in different groups.*P＜0.05,**P＜0.01 vs control group;#P＜0.05,##P＜0.01 vs MPEs group.

2.5 睾丸组织Nrf2 信号通路关键蛋白Nrf2、Keap1 和HO-1的表达

与对照组相比，MPEs组大鼠睾丸中Nrf2和HO-1表达水平升高（P＜0.05），而Keap1表达水平降低（P＜0.01）；与MPEs组相比，MPEs+M-Que组Nrf2和HO-1表达水平降低（P＜0.05），MPEs+H-Que组Nrf2表达水平亦降低（P＜0.01）；MPEs+M-Que 组和MPEs+H-Que 组Keap1表达水平较MPEs组均升高（P＜0.05，图4）。

图4 睾丸组织Nrf2信号通路关键蛋白的表达Fig.4 Expressions of key proteins of the Nrf2 signaling pathway in the testis in different groups.A:Western blots of testicular Keap1,Nrf2 and HO-1.B:Expression level of Keap1 in the testis.C:Expression level of Nrf2 in the testis;D:Expression level of HO-1 in the testis.*P＜0.05,**P＜0.01 vs control group;#P＜0.05,##P＜0.01 vs MPEs group.

2.6 睾丸组织Nrf2信号通路关键蛋白（Keap1和Nrf2）的表达

与对照组相比，MPEs 组Keap1 荧光信号明显降低，而Nrf2荧光信号明显升高；与MPEs组相比，MPEs+L-Que组、MPEs+M-Que组和MPEs+H-Que组大鼠睾丸组织中Keap1的荧光信号呈不同程度升高趋势，而睾丸组织中Nrf2荧光信号呈不同程度降低趋势（图5）。

图5 睾丸组织Nrf2信号通路关键蛋白（Keap1和Nrf2）的表达Fig.5 Expression of the key proteins (Keap1 and Nrf2) of the Nrf2 signaling pathway in the testis detected by immunofluorescence assay(×200).A:Expression of Keap1 in the testis.B:Expression of Nrf2 in the testis.Bar=100 μm.

3 讨论

本研究模拟人群PEs混合物暴露的实际特征，研究了3 种常见PEs（DEHP、DBP、BBP）的等毒性混合物MPEs 对睾丸组织的氧化损害作用，及Que 抑制MPEs暴露所致睾丸氧化损伤可能的作用机制。根据文献［9,14,25-28］，设定MPEs暴露剂量为900 mg/(kg·d)，Que干预剂量为10、30、90 mg/(kg·d)。青春期是生殖系统发育及性激素合成代谢的关键期，本研究选用青春期雄性SD大鼠，对其处理30 d后发现，MPEs暴露导致大鼠肛殖距、睾丸与附睾质量及其脏器系数、血清睾酮、FSH、LH水平显著降低以及大鼠睾丸组织病理结构的异常改变，提示MPEs暴露对SD大鼠睾丸组织具有损害作用；而Que可减轻这些生殖功能相关指标的异常改变，抑制MPEs对大鼠睾丸组织的损害作用。

动物体质量、脏器质量和相对脏器质量是一般毒性评价的重要指标［29,31］。据报道，500 mg/kg邻苯二甲酸二丁氧基乙酯在大鼠妊娠第12～21天灌胃染毒可导致雄性幼鼠肛殖距缩短、体质量降低、血清睾酮水平降低、胎儿睾丸间质细胞增生和异常集聚［31］。本研究中，MPEs暴露可导致大鼠睾丸、附睾质量及其脏器系数减小和肛殖距缩短，提示MPEs暴露对大鼠雄性生殖系统产生了损害作用。MPEs组大鼠睾丸曲细精管明显萎缩，精细胞明显减少，睾丸间质细胞增生，睾丸间质中有大量脂滴存在等症状亦表明MPEs暴露可导致睾丸组织损伤。在生精过程中，睾酮、FSH和LH是维持雄性生殖功能重要的内分泌调节因子，FSH与LH共同调控睾酮生成，维持正常的精子发生［32］。本研究中，MPEs暴露亦导致血清睾酮、FSH、LH水平显著降低，提示MPEs暴露对雄性激素合成及分泌产生了不良影响；这一结果与他人研究结果［33］一致，即DBP 100、250、500 mg/(kg·d)灌胃染毒28 d，血清睾酮、FSH、LH水平显著降低，睾丸组织结构损伤，精子活力下降。而Que逆转了上述生殖功能相关指标的变化，改善了睾丸组织病理结构，提示Que可改善MPEs暴露所致的睾丸损伤。

据报道，PEs暴露可诱导自由基大量产生，诱发机体氧化应激导致氧化损伤［34］。生理状态下，机体中自由基的生成与消除处于动态平衡之中；当受到氧化刺激时，机体产生大量的自由基，可诱发机体氧化应激导致细胞和组织氧化损伤［11-13］。MDA是重要的氧化应激生物标志物，可反应氧化应激的损伤程度［35］。本研究中，MPEs暴露可致SD大鼠睾丸组织MDA水平显著增高，提示MPEs暴露导致大鼠睾丸氧化应激；这与Zhou等［36］的研究结果一致；MPEs 联合Que 干预组睾丸组织MDA水平较MPEs组呈不同程度降低趋势，提示Que可缓解MPEs暴露所诱导的大鼠睾丸组织氧化应激损伤；MPEs+M-Que组和MPEs+H-Que组睾丸组织病理结构得到明显改善进一步证实了这一论点。

氧化应激可激活Nrf2信号通路以抑制脂质过氧化［11-13］。生理条件下，Nrf2与细胞质中Keap1蛋白结合，抑制Nrf2进入细胞核发挥转录活性。而在氧化应激条件下，Keap1中的半胱氨酸残基被氧化，Nrf2解离，定位到细胞核，与抗氧化反应元件结合，诱导关键抗氧化基因的反式激活，如HO-1、SOD、CAT、GPx等，以清除自由基，降低氧化应激［37］。据报道，800 mg/(kg·d)DBP灌胃染毒4周，升高了大鼠睾丸ROS水平，上调睾丸Nrf2，激活Nrf2信号通路，诱导睾丸HO-1和醌氧化还原酶1的增加［9］。本研究结果显示，MPEs 组大鼠睾丸组织Keap1表达降低，Nrf2表达升高，提示MPEs诱导的睾丸组织氧化应激激活了Nrf2信号通路，从而上调了睾丸组织中抗氧化酶的表达，如SOD、CAT、HO-1等；这可能是MPEs组大鼠睾丸组织中HO-1、SOD、CAT等抗氧化酶水平显著升高的原因。另一方面，Que可抑制MPEs暴露所诱导的睾丸组织中MDA、Nrf2、Keap1以及SOD、CAT和HO-1等水平的改变，提示Que可降低MPEs暴露所诱导的睾丸组织氧化应激；这与在肝组织中的研究相一致，即90 mg/(kg·d)Que抑制了900 mg/(kg·d)MPEs所诱导的肝组织MDA、keap1、Nrf2、及HO-1、SOD 和CAT等指标的改变，从而抑制了肝组织氧化损伤［22］。

然而，另有研究报道Que可通过激活Nrf2信号通路，上调Nrf2，促进下游靶基因HO-1、SOD、GSH等抗氧化酶的表达以抑制异烟肼诱导的肝细胞线粒体氧化损伤［38］。此外，有研究亦发现Que可通过激活Nrf2信号通路，上调HO-1表达改善镍诱导的小鼠肝氧化损伤［39］。研究表明，Que作为强抗氧化剂，可直接清除体内的自由基［40-42］；有研究显示Que（5、10 μmol/L）可通过直接清除活性氧自由基（ROS）以抑制高葡萄糖诱导的糖尿病大鼠睾丸损伤［43］。还有研究表明Que（50 μmol/L）可直接清除ROS以抑制阿特拉津对Sertoli细胞的氧化损伤［44］。本研究中，Que降低了MPEs暴露所诱导的氧化应激可能与Que直接清除自由基，恢复了Nrf2信号通路的调节有关。

综上所述，MPEs暴露诱导了大鼠睾丸组织氧化损伤，而Que可抑制MPEs所诱导的睾丸组织氧化损伤，可能与Que直接清除自由基，降低睾丸组织氧化应激，恢复了Nrf2信号通路的调节有关。