NKD1可促进结肠癌细胞的葡萄糖吸收:基于激活YWHAE基因的转录活性

刘迁，戴宇阳，于华裔，沈颖，邓建忠，陆文斌，金建华

1江苏大学附属武进医院/徐州医科大学武进临床学院，肿瘤科，江苏常州 213017；2常州市分子诊断与肿瘤精准医学重点实验室/江苏大学武进分子诊断与肿瘤精准医学研究院，江苏常州 213017

结肠癌是全球癌症导致死亡的常见病因之一［1］，尽管近几年胃肠镜的普及使结肠癌的死亡率有所下降［2］，但仍有部分患者被发现时已经为晚期，预后较差［3］，现阶段结肠癌的发病机制尚不明确，急需研究新的分子机制以解决未满足的临床需求，提高结肠癌患者的预后。

裸角质膜同源蛋白（NKD）于果蝇体内最先被发现，随后相继报道了NKD 的两个同源物NKD1 和NKD2［4］。NKD1是裸角质层同源物1，NKD1结构域含有的EF手样基序与杂乱蛋白相互结合［5］。相关研究报道，NKD1在急性白血病［6］、肺癌［7］及骨肉瘤［8］等中低表达，并且其作为Wnt信号途径抑制因子发挥功能［9,10］。我们前期研究发现NKD1在结肠癌组织及细胞中高表达，且能促进结肠癌细胞的增殖［11］，但是，NKD1促进结肠癌细胞增殖的分子机制尚不清楚。

YWHAE是酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸5-单加氧酶活化蛋白，也称为14-3-3ε，是14-3-3家庭的成员。具有高度调节多种细胞功能的保守序列，包括细胞周期调节［12］，信号转导［13］，粘附和恶性转化［14］。有研究表明YWHAE能调控细胞对葡萄糖的摄入［15,16］。我们前期通过酵母双杂交技术发现NKD1与YWHAE在结肠癌细胞中相互结合［17］，并且NKD1可能影响糖代谢过程［18］，因此我们想进一步探讨在结肠癌细胞对葡萄糖摄取过程中NKD1与YWHAE的相互作用机制，且目前尚无相关研究报道，具有一定的价值。

1 材料和方法

1.1 材料

人结肠癌细胞（HCT116、SW620）、以及实验室构建的稳定过表达NKD1的HCT116-NKD1细胞系、敲除nkd1 基因的SW620-nkd1-/-细胞系、培养基DMEM、1640（Gibco）、胎牛血清（Gibco）

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 HCT116 在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中培养。SW620在含有10%胎牛血清的1640培养基中培养。

1.2.2 细胞处理及分组（1）Western blot 实验：转染pcDNA3.0 质粒的HCT116 细胞系为对照组，转染pcDNA3.0-NKD1质粒的HCT116细胞为实验组；转染NC siRNA的SW620细胞为对照组，转染NKD1 siRNA的SW620细胞为实验组；（2）qRT-PCR实验：HCT116-NKD1 细胞为实验组，正常HCT116 细胞为对照组；SW620-nkd1-/-细胞为实验组，正常SW620细胞为对照组；（3）葡萄糖吸收实验：SW620-nkd1-/-细胞系、转染pcDNA3.0-YWHAE质粒的SW620-nkd1-/-细胞系为实验组，正常SW620细胞系为对照组。

1.2.3 Western blot 使用RIPA裂解液（Biosharp）裂解细胞，金属浴加热，获得蛋白样品。具体实验步骤请参考前期发表文章［19］。转入二抗（辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG，1∶5000，上海生工），室温孵育1 h，PBST洗涤3次，每次5 min。在膜上滴加显影液（Biosharp），利用化学发光成像系统进行检测。

1.2.4 qRT-PCR 过表达、敲降NKD1 及其对照细胞，TRIzol抽提细胞的总RNA，逆转录成cDNA，以其为模版进行检测。以人GAPDH为内参，分别检测各组细胞中YWHAE的表达。PCR扩增条件为：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30个循环；72 ℃延伸5 min。

1.2.5 染色质免疫共沉淀实验（ChIP）根据High-Sensitivity ChIP 试剂盒（Abcam）的说明进行实验。NKD1 蛋白YWHAE 启动子复合物由NKD1 抗体（185082,Abcam）免疫沉淀，IgG 作为阴性对照。ChIP引物分别为CHIP-qPCR F：GAGTGCTGGCAATGAG AATAAAC；CHIP-qPCR R：GTGCTGGAAACAGAG CAAATC。具体方法请参阅前期发表文章［20］。

1.2.6 双荧光素酶报告基因实验 根据Dual-Luciferase reporter assay system 试剂盒（Promega）的说明以及我们前期发表文章［20］。

1.2.7 细胞免疫荧光 将细胞铺入带有玻片的6孔板，过夜。PBS洗3次，加入4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗3次，5 min/次，加入0.5%Triton X-100通透20 min，PBS洗3次，5 min/次，玻片滴加BSA室温封闭，1 h，一抗4 ℃过夜，PBST洗3次，每次5 min，滴加荧光二抗，室温避光孵育2 h，同上洗涤，滴加DAPI室温避光孵育10 min，同上洗涤，50%甘油封片，荧光显微镜下拍摄。

1.2.8 葡萄糖吸收测定 细胞计数铺板，培养24 h后，PBS洗1遍，加入新鲜培养基，以此为0 h检测点，依次检测2、4、6、8、10、12h等（根据葡萄糖浓度变化快慢决定检测时间间隔和检测终止时间），每个样品设3个复孔，每孔加入5 μL样品和195 μL工作液，放置37 ℃细胞培养箱30 min后，酶标仪检测492 nm波长。绘制标准曲线图，根据葡萄糖浓度计算公式，计算出每个时间点葡萄糖浓度。（具体参考葡萄糖检测说明书）。

1.3 统计学分析

采用SPSS17.0统计软件进行处理，各指标以均数±标准差表示，多组采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。所有实验都独立重复3次。

2 结果

2.1 NKD1上调YWHAE蛋白的表达

Western blot检测结果显示转染pcDNA3.0-NKD1质粒的HCT116细胞系中YWHAE蛋白表达量明显高于对照组，其差异具有统计学意义（P＜0.001，图1A），转染NKD1 siRNA的SW620细胞系中YWHAE蛋白表达量明显低于对照组，其差异具有统计学意义（P＜0.01，图1B）。

图1 NKD1在蛋白水平正调控YWHAE的表达Fig.1 NKD1 positively regulates the expression of YWHAE at the protein level.A:Western blotting for detecting YWHAE expression in the HCT116 cells transfected with pcDNA3 or pcDNA3-NKD1 plasmids.B:Western blotting for detecting YWHAE expression in the SW620 cells transfected with negative control(NC)siRNAor NKD1 siRNA.**P＜0.01,***P＜0.01.

2.2 NKD1转录水平调控YWHAE的表达

qRT-PCR实验结果显示在结肠癌HCT116-NKD1细胞系中YWHAE转录水平的表达量明显高于对照组，其差异具有统计学意义（P＜0.001，图2A）。在结肠癌SW620-nkd1-/-细胞系中YWHAE转录水平表达量显著低于对照组，其差异具有统计学意义（P＜0.001，图2B）。

图2 NKD1在转录水平调控YWHAE基因的表达Fig.2 NKD1 regulates YWHAE gene expression at the transcriptional level.A:Real-time quantitative PCR for detecting YWHAE mRNA expression in HCT116 cells or HCT116-NKD1 cells.B:Real-time quantitative PCR for detecting YWHAE mRNA expression in SW620 cells or SW620-nkd1-/-cells.***P＜0.01.

2.3 NKD1激活YWHAE基因的转录活力

ChIP实验检测发现，NKD1可以结合YWHAE基因的启动子序列（图3A）。双荧光素酶报告基因实验发现，过表达NKD1能明显增强YWHAE启动子的转录活性，其差异具有统计学意义（P＜0.05，图3B）；与对照组相比，通过NKD1 siRNA敲降NKD1导致YWHAE基因启动子活性降低了将近一半，其差异具有统计学意义（P＜0.01，图3C）。

图3 NKD1激活YWHAE基因的转录活力Fig.3 NKD1 activates the transcriptional activity of YWHAE gene.A:Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay for detecting binding of NKD1 to the promoter region of YWHAE gene.B-C:Dual-luciferase reporter gene assay for analysis of the effects of overexpression or knockdown of NKD1 on YWHAE gene promoter activity.Basic:pGL3-Basic;YWHAE pro:pGL3-YWHAE promoter.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.01.

2.4 NKD1与YWHAE相互结合

免疫荧光结果显示NKD1和YWHAE蛋白在细胞内存在明显共定位，DAPI染色细胞核，NKD1蛋白带有GFP蛋白标签显示绿色，YWHAE蛋白为红色标记，当NKD1蛋白与YWHAE蛋白共定位会显示黄色（×100），结果显示出二者的共定位在细胞质、细胞核中均有分布（图4）。

图4 免疫荧光显示NKD1与YWHAE蛋白细胞内共定位情况Fig.4 Immunofluorescence assay showing intracellular co-localization of NKD1 and YWHAE proteins(Original magnification:×100).

2.5 NKD1通过YWHAE调节结肠癌细胞对葡萄糖的吸收

与正常SW620 细胞系相比，敲除nkd1 基因的SW620-nkd1-/-细胞系对葡萄糖的吸收能力显著降低，其差异具有统计学意义（P＜0.01）。而在SW620-nkd1-/-细胞系中再过表达YWHAE后，相比于SW620-nkd1-/-细胞系，结肠癌细胞对葡萄糖的吸收能力又明显增加，其差异具有统计学意义（P＜0.05，图5）。

图5 葡萄糖吸收实验分析NKD1通过YWHAE调控细胞对葡萄糖的吸收Fig.5 Glucose uptake assay for assessing the regulatory effect of NKD1 on cellular glucose uptake via YWHAE.*P＜0.05;**P＜0.01.

3 讨论

我们前期通过酵母双杂交系统筛查出结肠癌细胞中与NKD1相互结合的YWHAE蛋白［17］。且有相关文献报道YWHAE、NKD1在糖代谢中具有一定的作用［15,16,18］，故本研究重点研究NKD1与YWHAE在调控结肠癌细胞葡萄糖吸收过程中的相互作用机制。

本研究首次发现NKD1可以在蛋白和转录水平调控YWHAE基因的表达，并进一步通过ChIP技术验证了NKD1蛋白与YWHAE启动子相互结合。但是我们对NKD1蛋白序列分析发现NKD1并不含有锌指结构，从而NKD1不具有转录因子功能，又因其与YWHAE基因启动子序列结合，故NKD1蛋白可能发挥辅转录因子的功能。在研究NKD1与YWHAE相互作用机制时，免疫荧光实验发现，NKD1与YWHAE蛋白在结肠癌细胞中相互结合，并且二者共定位于细胞质与细胞核中，因此NKD1定位于细胞核中的蛋白很可能参与基因转录方面的功能。

葡萄糖代谢异常是肿瘤发展最显著的特征之一［21-23］，肿瘤细胞是通过瓦博格效应（即肿瘤细胞在供氧充足的情况下，通过糖酵解的方式来获得能量）来消耗较多的葡萄糖以获取能量［24-26］。胰岛素样生长因子-1［27,28］、真菌［29］等在结肠癌细胞葡萄糖代谢中发挥一定的作用，但YWHAE、NKD1在结肠癌细胞葡萄糖代谢中的作用尚无相关报道，因此本次研究通过葡萄糖吸收实验首次发现NKD1可以通过调控YWHAE的表达进而促进结肠癌细胞对葡萄糖的吸收。结合既往研究表明，在结肠癌细胞中YWHAE与NKD1相互结合［17］。另外，YWHAE、NKD1在结肠癌组织中表达上调，促进结肠癌发生发展［11,30,31］，且与葡萄糖代谢相关［16,18］，进一步支持此次研究结果。另外本研究发现的NKD1促进结肠癌细胞对葡萄糖的吸收也是支持NKD1促进结肠癌细胞增殖的新证据，本研究发现的NKD1-YWHAE轴为NKD1促进结肠癌进展提供了新的研究方向，该作用轴也可能为临床上结肠癌患者的治疗提供新的治疗靶点。