电针可改善骨关节炎大鼠的关节炎症和运动功能：基于调控Wnt-77B/β-catenin信号通路

郑祥，高颂爱，尤浩，王浩琦，高彦平，王金丽，李嘉，李玲

1河北省承德医学院，河北承德 067000；2河北省承德医学院附属医院中医科，河北承德 067000；3南方医科大学第三附属医院中医骨伤科，广东广州 510630；4广东省人民医院风湿免疫科，广东省医学科学院，广东广州 510080

膝骨关节炎（KOA）严重影响患者的生活质量，也给社会带来了巨大的经济负担［1-3］，美国每年KOA 患者的医疗消耗约为8000万美元［4,5］。骨关节炎晚期患者只能行关节置换手术，但有10%～20%的患者在术后因疼痛、僵硬、日常活动受限等原因感到不满［6］。早期膝关节炎的保守治疗方案越来越受到重视。现代医学对于早期膝骨关节炎的治疗主要以控制体质量、运动、药物等治疗为主［7］，但其治疗手段复杂多变，治疗效果参差不齐［8-10］。近年来，电针被认为是一种能有效改善KOA症状的非药物的物理治疗方式［11,12］，但是也有部分研究对于电针的治疗效果持保留意见［13,14］。关于电针治疗KOA的研究大多局限于关节某一组织或血液中细胞因子的变化，较为单一和局限。KOA的病理机制尤为复杂，各种炎症因子之间也相互作用。本研究旨在从关节功能、软骨、软骨下骨和标志性细胞因子的改变及其改变机制多个方面出发，探究电针对于治疗骨关节炎的有效性及其作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物与分组

健康雄性清洁级SD大鼠30只，体质量200±10 g，所有大鼠分笼饲养，由专人负责管理。实验室定期消毒，环境温度23±2 ℃，相对湿度50%～70%。所有大鼠适应性饲养1周后开始实验。按照随机数字表法将大鼠分为模型组、电针组与对照组，10只/组。模型组大鼠予以改良DMM法建立膝骨关节炎模型，后不予以任何治疗干预；电针组大鼠以同样的方法建立膝骨关节炎模型后予以电针治疗；对照组只打开关节腔后缝合，韧带、半月板和关节软骨保持完整，后不予以任何治疗干预。本研究通过动物伦理委员会审核批准（IACUC-20210510-04）。

1.2 主要药物与试剂

电子针疗仪（英迪，常州电子医疗器械有限公司），一次性不锈钢针灸针（0.18 mm×13 mm，苏州医疗用品厂有限公司）；micro-CT（日本Aloka Latheta LCT-200，HITACHI）；白细胞介素-1β（IL-1β）ELISA试剂盒（欣博盛生物）；基质金属蛋白酶-3（MMP-3）ELISA试剂盒（北京迈瑞达科技有限公司）；聚蛋白多糖酶-7（ADAMTS-7）；ELISA试剂盒（美国Signalway Antibody）；软骨寡聚基质蛋白（COMP）ELISA 试剂盒（AMEKO）；IL-1β抗体（Invitrogen）、Wnt-7B 抗体（Abmart）、β-catenin 抗体（CST）、ADAMTS-7抗体（HUABIO/华安生物）、MMP-3抗体（SAB Signalway Antibody）、COMP 抗体（SAB SignalwayAntibody）。

1.3 模型制备

模型组与电针组大鼠采用改良DMM法建立膝骨关节炎模型。造模方法：腹腔注射2 mL/kg戊巴比妥钠（30 g/L）麻醉大鼠，于无菌条件下打开关节腔后切除大鼠右膝内侧半月板及内侧副韧带，后将损伤结构逐层缝合，术后向大鼠肌内注射20 U青霉素以预防感染，1次/d，连续3 d［15］。术后2周造模成功后进行后续干预。对照组只打开关节腔后逐层缝合，韧带、半月板和关节软骨保持完整。

1.4 干预方法

1.4.1 模型组 造模后正常抓取、捆绑固定，1次/d，每次15 min，连续20 d。

1.4.2 电针组 造模成功后，将大鼠固定在固定架上，参照中国针灸学会实验针灸研究会制定的《实验动物针灸穴位图谱》，取“后三里”和“膝前穴”，选用0.18 mm×13 mm的一次性毫针垂直进针，刺入4 mm于目标穴位后针柄接入电子针疗仪进行连续波刺激，频率保持在10 Hz左右，强度调节至0.5 mA，以局部肌肉轻度跳动且大鼠不挣扎为度，连续刺激15 min，1次/d，连续20 d。

1.4.3 对照组 假手术后正常抓取、捆绑固定，1次/d，每次15 min，连续20 d。

1.5 观察指标

1.5.1 行为学检测 由同一位经过培训的医师从疼痛程度、步态改变、关节活动范围、关节肿胀度4个方面，对电针组大鼠于模型制备前、制备模型后2周和治疗20 d（模型制备后34 d）后进行大鼠行为学评测；对模型组大鼠于模型制备前、模型制备后2周以及模型制备后34 d进行大鼠行为学评测；对照组大鼠于假手术前、假手术后2周以及假手术后34 d进行大鼠行为学评测，根据LequesneMG量表［16］进行评分，分数越高说明症状越严重。具体评分标准（表1）。

表1 LequesneMG评分标准Tab.1 LequesneMG scoring criteria

1.5.2 Micro-CT检测 在电针组大鼠于治疗20 d（模型制备后34 d）、模型组大鼠于模型制备后34 d、对照组大鼠于假手术后34 d后进行膝关节micro-CT扫描。将大鼠麻醉固定于micro-CT床进行扫描，之后借助micro-CT系统配套的软件对扫描数据进行结构重建，利用三维旋转功能选取膝关节胫骨平台区域软骨下骨进行分析，并对骨组织进行分析。分析指标：骨体积分数（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁数量（Tb.N）、骨小梁分离度（Tb.Sp）。

1.5.3 ELISA检测按照IL-1β、ADAMTS-7、MMP-3的ELISA试剂盒子上的操作方法在电针组大鼠于治疗20 d（模型制备后34 d）、模型组大鼠于模型制备后34 d、对照组大鼠于假手术后34 d后使用ELISA 检测大鼠血清关节液中的IL-1β、ADAMTS-7、MMP-3的含量。

1.5.4 Western blot检测 在电针组大鼠于治疗20 d（模型制备后34 d）、模型组大鼠于模型制备后34 d、对照组大鼠于假手术后34 d后摘取大鼠膝关节，剥离软骨组织，将软骨组织粉碎；取少量软骨组织称重，每20 mg样本加200～400 μL 裂解液，于4 ℃下15 000 r/min 离心10 min，取上清液，对待测蛋白进行上样，依次完成电泳、转膜、封闭及免疫印迹显色等步骤。采用Image J软件分析条带灰度值。以目的蛋白条带与GAPDH灰度比值表示蛋白相对表达水平，检测各组大鼠右侧膝关节软骨组织IL-1β、Wnt-7B、β-catenin、ADAMTS-7、MMP-3蛋白表达水平。

1.5.5 Real-time qPCR检测 在电针组大鼠于治疗20 d（模型制备后34 d）、模型组大鼠模型制备后34 d、对照组大鼠假手术后34 d后使用RT qPCR检测各组大鼠软骨组织中IL-1β、ADAMTS-7、MMP-3的mRNA表达。反应总体系为20 μL，反应条件为：98 ℃预变性5 min，98 ℃变性30 s，68 ℃退火30 s，延伸90 s，共30个循环。

1.6 样本量估算

本研究开始时，完成了预实验，并根据既往研究及采用PASS软件计算本实验所需样本量，样本量的计算基于α=0.05和β=0.90（双侧检验）及本研究中最重要的两个预实验指标，即炎症指标IL-1β表达情况：模型组、电针组和对照组分别为2.413±0.197、1.393±0.033 和1.024±0.030；炎症指标ADAMTS-7表达情况：模型组、电针组和对照组分别为2.899±0.311、1.635±0.334 和1.015±0.032，计算得出的样本量为每组2只，共需要6只。由于结局指标中的Micro-CT检测及骨组织分析、Western blot检测和Real-time qPCR检测三者中的所需大鼠样本不能用于其他结局检测，同时考虑到大鼠在养殖过程中可能出现死亡等情况，最终的样本量确定为每组10大鼠，共30只大鼠。

本次实验中，各种检测所用具体样本数如下：行为学检测：每组10只，共30只，无需处死大鼠；ELLAS检测：每组3只，共6只，无需处死大鼠；Western blot检测：每组2只，共6只；Micro-CT检测及骨组织分析：每组6只，共18只；Real-time qPCR检测：每组需2只，共6只。

1.7 统计学分析

统计学分析采用SPSS18.0软件，计量资料以均数±标准差表示，采用单因素方差分析法进行多组间比较，P＜0.05为差异有统计学意义，实验至少独立重复3次。

2 结果

2.1 行为学检测

LequesneMG评分显示，模型制备以及假手术前3组大鼠LequesneMG评分差异无统计学意义（P＞0.05）。模型制备后与对照组相比，模型组、电针组LequesneMG评分升高（P＜0.05）。治疗20 d后，与模型组比较，电针组LequesneMG评分降低（P＜0.05，表2）。

表2 LequesneMG评分Tab.2 LequesneMG score of the rats at different time points(n=6,Mean±SD)

2.2 Micro-CT检测

根据大鼠膝关节micro-CT扫描结果显示，观察各组大鼠胫骨平台软骨下骨情况（图1）。与对照组相比，模型组大鼠软骨下骨损伤较电针组明显（P＜0.05）。骨组织分析结果显示，与模型组相比，电针组BV/TV、Tb.Th、Tb.N上升，Tb.Sp降低，差异有统计学意义（P＜0.05，表3）。

表3 骨组织分析结果Tab.3 Results of bone tissue analysis(n=6,Mean±SD)

图1 大鼠胫骨平台软骨下骨情况Fig.1 Micro-CT scanning of the subchondral bone of the tibial plateau of the rats.A:Model group.B:Electroacupuncture group.C:Control group.

2.3 ELLAS检测

模型组大鼠血清中IL-1β、ADAMTS-7、MMP-3和COMP含量较对照组均上升（P＜0.01）；与模型组比较，电针组血清中IL-1β、ADAMTS-7、MMP-3和COMP含量均降低（P＜0.05，图2）。

图2 血清中IL-1β、ADAMTS-7、MMP-3和COMP的表达情况Fig.2 Serum levels of IL-1β,ADAMTS-7,MMP-3 and COMP in the 3 groups determined with ELISA.A:Expression of IL-1β in serum;B:Expression of ADAMTS-7 in serum;C:Expression of MMP-3 in serum;D:Expression of COMP in serum.**P＜0.01 vs control group;#P＜0.05 vs model group.

2.4 Western blot检测

模型组大鼠软骨组织中IL-1β、Wnt-7B、β-catenin、ADAMTS-7及MMP-3 较对照组均上升（P＜0.01）；与模型组比较，电针组大鼠软骨组织中IL-1β、Wnt-7B、βcatenin、ADAMTS-7、MMP-3含量均降低（P＜0.01，图3）。

图3 采用Western blot法检测各组软骨细胞中IL-1β、Wnt-7B、β-catenin、ADAMTS-7及MMP-3蛋白表达的条带图Fig.3 Western blotting for detecting IL-1β,Wnt-7B,β-catenin,ADAMTS-7 and MMP-3 protein expressions in the chondrocytes in each group.**P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs model group.

2.5 Real-time qPCR检测

模型组软骨组织中IL-1β、Wnt-7B、β-catenin、ADAMTS-7 和MMP-3 mRNA 较对照组均上升（P＜0.01）；与模型组比较，电针组IL-1β、ADAMTS-7、MMP-3 mRNA含量均降低（P＜0.05，图4）。

图4 IL-1β、Wnt-7B、β-catenin、ADAMTS-7和MMP-3 的表达情况Fig.4 Real-time PCR for detecting mRNA expression of IL-1β,Wnt-7B,β-catenin,ADAMTS-7 and MMP-3 in the chondrocytes in each group.A:The expression of IL-1β in cartilage tissue;B:The expression of Wnt-7B in cartilage tissue;C:The expression of β-catenin in cartilage tissue;D:The expression of ADAMTS-7 in cartilage tissue;E:The expression of and MMP-3 in cartilage tissue.**P＜0.01 vs control group;#P＜0.05 vs model group.

3 讨论

KOA是一种老年群体中常见的以关节内的异常炎症反应以及软骨等组织的破坏为主要特征的退行性病变，但目前临床还没有彻底治愈KOA的方案［17］。电针具有疏通气血、疏经通络、降低炎症等作用。近年来电针疗法在KOA的临床治疗上运用的愈发广泛，研究指出电针是一种治疗KOA优于多数非手术治疗的非药物物理治疗，有学者通过对照研究发现电针治疗KOA在疼痛、关节功能、肌肉力量以及患者生活质量方面疗效均优于口服硫酸氨基葡萄糖胶囊［18］。但一些研究也对电针治疗KOA的效果提出了保留意见，有学者在指南中并不推荐KOA患者使用电针治疗［19］。可见学界对电针治疗的有效性存在着不同观点。为进一步证明电针对KOA的治疗效果，本研究采用大鼠建模，并将大鼠随机分为模型组、电针组及对照组，在模型制备后34 d分别进行行为学分析、Micro-CT检测及炎因子测定，结果发现电针的治疗效果显著。LequesneMG评分近年来越来越多地被应用在评估KOA患者病情当中，且研究表明LequesneMG评分在亚裔膝骨关节炎患者的评价中具有可靠性及有效性［20］，因此本研究采用动物LequesneMG评分，从多个角度、更加全面的评估电针对于KOA的治疗效果。本研究发现，与模型组相比，大鼠经过电针治疗后，其疼痛程度得到缓解，跛行、行走无力等病理步态改变也得到了改善，关节活动度提高，同时Micro-CT也显示关节的肿胀程度也得到改善，这提示电针在缓解KOA症状方面有效。

目前，电针对OA的作用机理尚未完全阐明［14］。有研究表明，IL-1β能够促进膝关节滑膜和软骨细胞分泌前列腺素、一氧化氮等炎症因子，进而加重炎症反应［21-26］。有研究表明，IL-1β可激活Wnt-7B/β-catenin信号通路的高表达，从而激活下游分子ADAMTS-7的高表达，进而分解软骨细胞外基质中的COMP从而破坏软骨组织［27,28］，相反通过siRNA 抑制ADMTS-7 的表达能够抑制COMP的降解［29,30］。既往电针治疗骨关节炎的研究已经证明，通过降低ADAMTS家族以及MMPs家族在软骨组织等的表达，可有效地缓解KOA的进程［31-34］。有研究发现，电针通过调控Wnt/β-catenin 信号通路降低MMP-13的表达，减少炎性因子IL-1β的生成，从而抑制软骨基质的降解和软骨细胞的凋亡［31］；也有研究发现电针可以降低KOA 患者治疗前后血清ADAMTS-4、MMP-3含量，改善膝骨性关节炎患者的症状［32］。然而目前关于电针治疗骨关节炎的研究中，还未有研究人员关注过ADAMTS-7这一重要的促炎因子的变化，同时也未有研究有关电针作用ADAMTS-7表达的信号通路的变化。本研究从血清、软骨组织多角度证明电针可有效地降低骨关节炎中IL-1β的表达，也可以降低Wnt-7B、β-catenin、ADAMTS-7、MMP-3在软骨组织中的表达；此外，电针也降低了血清中的COMP。可见，电针通过抑制Wnt-7B/β-catenin 信号通路的表达，降低了软骨、血清中ADAMTS-7、MMP-3 的表达，同时降低了IL-1β的表达，减少了炎症反应对关节软骨的破坏，进而延缓了关节炎的发生发展；而血清中COMP的降低也进一步证明，通过电针治疗ADAMTS-7对于软骨组织的破坏作用被减弱。

本研究也发现，电针可以在一定程度上缓解大鼠膝关节软骨下骨早期的损伤。软骨下骨异常的骨重塑是KOA的典型标志，在OA早期，异常的骨吸收导致骨量减少［35,36］。软骨下骨骨质疏松样改变，骨量减少，骨小梁间隙增加，软骨下骨板变薄，使得软骨下骨的生物力学性能受损，进而诱发或加重关节软骨损伤［37,38］。目前对于电针治疗KOA的研究多数致力于软骨组织方面，而关于软骨下骨具体改变的研究仍较为匮乏。有研究证明，通过电针治疗后，可以减缓软骨下骨的骨质疏松改变［39］。有学者通过对比研究发现，电针治疗后的KOA兔模型软骨下骨未发生病变，而对照组软骨下骨受损明显［40］。而软骨下骨的病变对于KOA的发生发展至关重要［41-43］。本研究在既往研究的基础上，通过大鼠膝关节micro-CT的扫描发现，模型组大鼠软骨下骨损伤破坏较为明显，而通过电针治疗的大鼠软骨下骨的形态较为规整，较模型组破坏程度明显降低。骨组织分析发现，与模型组相比，电针组大鼠软骨下骨的骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数量均有所上升，差异有统计学意义（P＜0.05），而骨小梁分离度有所下降，差异有统计学意义（P＜0.05），以上检测指标的改变说明通过电针治疗后的大鼠膝关节软骨下骨的骨质破坏得到了一定程度的缓解，从而延缓了KOA的发展进程。由此可见，电针可以改善膝关节炎早期软骨下骨的损伤，延缓疾病的发生发展。

综上所述，电针能够有效改善关节疼痛等症状，同时改善关节软骨下骨的破环，并且可以降低关节软骨组织、血清中IL-1β缓解关节内炎症，同时可能通过调控Wnt-7B/β-catenin信号通路降低ADAMTS-7、MMP-3等细胞因子，起到保护软骨的作用。然而，一些研究也对电针治疗KOA的效果提出了保留意见［18］，因此仍需更多的研究证明电针治疗KOA的有效性以获得国际社会的一致认可。