脓毒症促内质网RyR1受体磷酸化增强导致大鼠膈肌功能障碍

吴松林，李学欣，关发升，冯建国，贾静，李京，刘力

西南医科大学1附属医院麻醉科，2麻醉与重症医学中心实验室，四川泸州 646000

脓毒症相关膈肌功能障碍（SIDD）是由脓毒症引起的膈肌功能障碍和无力［1］。在重症监护病房需要插管的危重症患者中膈肌功能障碍的患病率超过60%，是导致患者脱机困难，延长住院时间，增加患者死亡率的重要原因［1,2］。关于SIDD的发生制目前尚不清楚。有研究结果表明SIDD的发生与炎症反应、氧化应激、代谢失衡、线粒体功能障碍、内质网应激、肌肉凋亡和萎缩有关［3-5］。RyR1是细胞内质网上钙离子（Ca2+）释放通道，在骨骼肌兴奋－收缩偶联中发挥重要作用，骨骼肌收缩时所需要的游离Ca2+大部分是由内质网通过RyR受体释放到胞浆中，引起肌肉收缩［6］。研究表明，急性脓毒症引起的膈肌无力可能与RyR表达水平有关［7］。脓毒症可以改变心肌细胞内质网RyR2的磷酸化水平导致心肌收缩功能障碍［8］。对于脓毒症引起的RyR1受体表达及其磷酸化修饰的改变是否参与SIDD的发生发展目前尚缺乏研究。因此，本实验通过动物模型，研究不同病程阶段的脓毒症对膈肌内质网RyR1受体表达及其磷酸化水平的影响，通过干预表达调控，阐明RyR1的表达量变化及其磷酸化在SIDD发生发展中的作用，为临床治疗相关膈肌功能障碍提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 实验动物

8～12周龄SPF级SD雄性大鼠（成都达硕实验动物有限公司），体质量200～220 g，饲料、水源和垫料由西南医科大学提供。本实验经过西南医科大学动物伦理委员会伦理审核（动物伦理审批编号：20220927-006）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 根据前期盲肠结扎穿孔术（CLP）建模成功率设置样本量，按随机数字表法将SD大鼠分成5组。假手术组（Sham组）：行开腹盲肠探查术，在相应观察点进行指标检测及标本取材；CLP-6 h组、CLP-12 h组、CLP-24 h 组：通过CLP 构建脓毒症模型，分别于6、12、24 h 后进行指标检测及标本取材；KN-93 组（CLP-24 h+KN-93组）：CLP建模手术完后立即腹腔注射KN-93 3.327×10-3mmol/kg［9］，于24 h后进行指标检测及标本取材。

1.2.2 动物模型构建 参照Susanne Drechsler［10］方法，采用CLP构建脓毒症大鼠模型，具体步骤如下：将大鼠以仰卧位固定于动物实验操作台上。大鼠术前禁食12 h，可自由饮水。于腹腔注射戊巴比妥钠50 mg/kg麻醉大鼠，沿腹中线中下部向左旁0.5～1 cm，作长约1.5～2 cm的纵行切口，探查盲肠，于回盲瓣到盲肠末端距离的1/2处结扎，避免结扎肠系膜血管以及回盲部，以保证肠道通畅避免肠梗阻坏死。用18号针头分别在盲肠结扎处远端和盲肠末端横贯穿孔2个，最后将盲肠回纳入腹腔，逐层缝合切口。皮下注射0.9%N.S 40 mL/kg，防止循环衰竭。

1.2.3 膈肌CMAP 检测 参照Martin 等方法［11］，通过RM6240系统记录CMAP。将SD大鼠仰卧位固定在手术板，使用脱毛膏去除肋下缘及腹部皮肤的毛发，使用聚维酮碘消毒。将电极片贴于右侧肋下缘，作为记录电极；将2根同心圆针电极垂直插入右侧锁骨上方，气管旁0.5 cm，深度为1 cm，2根同心圆针电极距离0.5 cm，作为刺激电极；刺激模式采用正电压单刺激（强度12 V，波宽1 ms，延时1 ms）。此时显示屏显示的波形即为CMAP，重复刺激3次，每次间隔30 s。

1.2.4 膈肌肌条收缩功能检测 在相应时间点处死大鼠，切除的隔肌条被安装到预先氧合的Krebs-Henseleit溶液中（1L主要包含：NaCl 118 mmol/L、KCl 4.7 mmol/L、MgSO41.2 mmol/L、KH2PO41.1 mmol/L、NaHCO325 mmol/L、CaCl22.4 mmol/L、葡萄糖5.5 mmol/L PH:7.4）［12］。使用脉冲方波（强度15 V，波宽0.5 ms，延时20 ms）对肌肉进行刺激，重复刺激3次，刺激间隔1 min。然后通过以10、20、30、50、60、80、100和120 Hz连续刺激肌肉600 ms，每个刺激训练间隔1 min以确定频率收缩曲线关系。在测量收缩特性后，测量肌肉的初长度Lo（肌肉产生最大等距张力的长度）和称重。然后另取一块膈肌修剪成条，以50 Hz连续刺激肌肉2 min确定膈肌的疲劳指数。膈肌力的产生按总肌条横截面积归一化，并以N·cm-2表示。用肌肉质量除以长度和组织密度（1.056 g/cm3）来确定总肌条截面积。

1.2.5 蛋白质印迹分析 取50 mg膈肌标本，用预冷的双蒸水称量修剪。加入蛋白酶裂解液（含1%蛋白酶抑制剂PMSF和1%磷酸酶抑制剂），低温离心后取上清提取总蛋白。用BCA蛋白定量试剂盒（beyotime，上海碧云天生物技术有限公司）检测肌肉蛋白的浓度。加入上样缓冲液，于沸水中进行蛋白变性10 min，置于-20 ℃冰箱保存备用。然后将样品加入Omni-PAGE™预制胶Hepes 4%～20%（LK206，雅酶，中国）中进行电泳分离后、采用湿转法于Omni-Flash免冰浴快速转膜缓冲液（10×）（PS201S，雅酶）中进行转膜5 h，将蛋白转移到NC膜上。用5%的脱脂牛奶进行封闭1 h（P-RyR1使用5%BSA进行封闭），洗膜后用相对应的一抗孵育过夜：RyR1 抗体（1∶1000）（Abcam）、P-RyR1 抗体（1∶500）（Affinity）、CaMKⅡ抗体（1∶1000）（SignalwayAntibody），以羊抗小鼠单克隆抗体β-actin（Santa Cruz Biotechnology）作为内参。用与一抗相匹配的二抗室温孵育1 h：辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠lgG（H+L）（beyotime，上海碧云天生物技术有限公司）、辣根过氧化物酶标记羊抗兔lgG（H+L）（Proteintech group）。采用Image J进行灰度值分析，以目的蛋白的灰度值与内参灰度值的比值反应目的蛋白的表达水平。

1.3 统计学处理

采用GraphPad8.3.0软件进行统计学分析。符合正态分布的数据以均数±标准差表示。实验数据采用Levene 检验方差齐性，方差齐下各组之间比较采用ANOVA分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 神经肌肉功能学

2.1.2 CMAP 各组CMAP电位见图1。CLP-24 h组较Sham组CMAP幅值明显下降（1.88±0.26 mVvs4.62±0.23 mV，P＜0.05）；CLP-24 h+KN-93组较CLP-24 h组的CMAP幅值明显上升（4.98±0.15 mvvs1.88±0.26 mV,P＜0.05）。CLP-6 h组、CLP-12 h组和Sham组之间差异没有统计学意义（P＞0.05，图1）。

CLP-24 h 组CMAP 的时程较Sham 组明显延长（9.91±1.13 msvs6.35±1.07 ms，P＜0.05），CLP-24 h+KN-93 组较CLP-24 h 组明显缩短（6.42±0.11 msvs9.91±1.13 ms，P＜0.05）；CLP-6 h 组、CLP-12 h 组和Sham组之间差异没有统计学意义（P＞0.05，图1）。

图1 各组大鼠脓毒症建模后CMAP幅值和时程比较Fig.1 Changes in amplitude and duration of compound muscle action potential (CMAP) of the diaphragm in rats after sepsis(Mean±SD).*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001.

2.1.3 膈肌疲劳指数 CLP-12 h组和CLP-24 h组的疲劳指数较Sham组明显增大（0.53±0.04vs0.69±0.05 vs 0.13±0.06，P＜0.05），CLP-24 h+KN-93组与CLP-24 h组膈肌疲劳指数差异无统计学意义（0.55±0.06vs0.69±0.05，P＞0.05，图2）。

图2 各组大鼠脓毒症建模后疲劳指数比较Fig.2 Fatigue index after sepsis modeling in each group (Mean±SD, n=6).A:Representative graph of diaphragmatic fatigue index.B:Effect of sepsis on diaphragmatic fatigue index in each group.**P＜0.01.

2.1.4 膈肌频率-收缩曲线 CLP-6 h组、CLP-12 h组、CLP-24 h组较Sham组的收缩力明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。CLP-24 h+KN-93组较CLP-24 h组的收缩力明显升高（P＜0.05），CLP-24 h组较CLP-6 h组和CLP-12 h组收缩力明显降低（P＜0.05，图3）。

图3 各组大鼠膈肌频率-收缩曲线比较Fig.3 Diaphragm frequency-contraction curves in each group (Mean ± SD).A:Representative graph of the diaphragm frequency contraction curve.B:Effect of sepsis on diaphragmatic frequency-contraction curves in each group.***P＜0.001 vs Sham group;＆P＜0.05 vs CLP-24 h group.

2.2 膈肌RyR1蛋白表达及其磷酸化水平

CLP-24 h组较Sham组的RyR1蛋白表达水平下降（P＜0.05），而CLP-24 h+KN-93组与CLP-24 h组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。CLP-6 h组、CLP-12 h组与Sham组差异无统计学意义（P＞0.05）。各组大鼠膈肌P-RyR1蛋白表达水平差异有统计学意义（P＜0.05）。与Sham组比较，CLP-6 h组、CLP-12 h组和CLP-24 h组的P-RyR1蛋白表达水平明显升高（P＜0.05），CLP-24 h+KN-93组的P-RyR1蛋白表达水平相比于CLP-24 h组明显降低（P＜0.05，图4）。

图4 各组大鼠膈肌RyR1蛋白表达及其磷酸化水平比较Fig.4 Expression and phosphorylation of RyR1 in the diaphragm of rats in each group(Mean±SD).A,B:Effect of sepsis on RyR1 expression in the diaphragm.C,D:Effect of sepsis on P-RyR1 expression in the diaphragm.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001.

2.3 膈肌CaMKⅡ表达水平

与Sham组比较，CLP-24 h组大鼠膈肌CaMKⅡ蛋白表达水平明显升高（P＜0.05），CLP-24 h+KN-93组的CaMKⅡ蛋白表达水平相比于CLP-24 h组明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05，图5）。

图5 各组大鼠膈肌CaMKⅡ蛋白表达水平比较Fig.5 Expression of CaMK II in the diaphragm of rats in each group detected by Western blotting(Mean±SD).*P＜0.05,**P＜0.01.

3 讨论

脓毒症是由宿主对感染的反应失调所引起的危及生命的器官功能障碍［13］，常导致多器官功能衰竭和死亡。本研究采用盲肠结扎穿孔的经典方法构建SIDD大鼠模型，观察脓毒症对大鼠膈肌功能的影响，结果发现，与对照组相比，脓毒症大鼠膈肌功能明显降低，具体体现在膈肌CMAP幅值降低，时程延长，疲劳指数明显升高以及不同频率刺激下膈肌收缩力下降。这与以往的研究结果相同［14-16］。随着脓毒症时间的延长，膈肌RyR1 受体表达水平降低，CaMKⅡ和P-RyR1 水平升高。施加干预以后，膈肌CaMKⅡ和P-RyR1水平降低，膈肌功能改善。

RyR是内质网上释放钙离子的一种大型配体门控通道，Ca2+通过肌质网上的RyR受体快速释放到胞浆中，启动兴奋-收缩耦联，引起肌肉收缩［6,17］。RyR受体改变与多种疾病的发生有关。有研究研究慢性脓毒症对大鼠危重症神经肌病快肌的影响中发现，在建立脓毒症模型10 d后，趾长伸肌收缩功能下降，RyR1的表达上升，虽然RyR1受体表达升高，但并不能排除RyR1受体的升高受其本身肌病的影响［18］。本研究发现，虽然脓毒症6 h和12 h组大鼠表现出明显的膈肌功能障碍，但其RyR1受体蛋白的表达水平并没有显著性的差异。但在脓毒症24 h组RyR1受体表达表现出了明显的差异，并且膈肌功能受损明显，其也不能排除RyR1受体表达量减少对膈肌功能的影响。研究表明，就调节内质网Ca2+释放而言，RyR蛋白的水平不如通道的活性重要［19,20］，因此脓毒症导致膈肌功能障碍可能是RyR1表达下降与RyR1活性改变共同作用的结果。

磷酸化以及去磷酸化是重要的细胞内的传导途径。研究表明RyR过度磷酸化可以增加其对钙离子敏感性，引起Ca2+紊乱，与心脏功能有着密切关系［21］。有研究在心力衰竭的患者中发现，RyR1 受体过度磷酸化使结构发生重塑，导致RyR1功能障碍，引起内质网Ca2+泄露，最终心肌收缩无力［22］；在脓毒症休克大鼠心肌中，随着脓毒症病情的发展，RyR受体磷酸化水平逐渐升高，心肌功能受损［8］。室性心律失常与心房颤动与RyR2受体磷酸化水平升高所致的心肌舒张期Ca2+泄露有关［23,24］，抑制CaMKⅡ，能够减轻心房颤动的易感性［23］。本研究发现，随着脓毒症病程的发展，RyR1受体的磷酸化水平逐渐升高，膈肌功能障碍逐渐加重，通过干预抑制钙调蛋白依赖性蛋白激酶II（CaMKⅡ）的表达，RyR1的磷酸化水平下降，膈肌功能改善。研究发现，CaMKII是一种多功能蛋白激酶，能导致RyR受体磷酸化导致其功能发生改变［8,25］，而KN-93能够抑制CaMKII，能降低RyR受体磷酸化水平，改善脂多糖介导的心脏重塑及心功能障碍［26］。因此，本实验采用KN-93进行干预后，RyR1受体的磷酸化水平降低，膈肌功能明显的改善。研究发现蛋白激酶A（PKA）激活，介导的RyR2磷酸化对心脏的收缩功能也非常重要［27］，因此PKA 介导的RyR1受体磷酸化也是本研究的局限性所在，SIDD期间PKA与RyR1之间的关系也需要进一步研究。

综上所述，脓毒症引起的膈肌功能障碍的机制是由于CaMKII的表达水平的升高，导致了RyR1受体磷酸化，磷酸化的RyR1受体结构功能发生改变，使Ca2+发生泄漏，进而导致膈肌的结构功能发生改变。而针对RyR1受体的磷酸化做出有效干预，有望成为临床新的治疗靶点。