RT-PCR/CRISPR-Cas12a 快速检测和区分SARS-CoV-2 Omicron BA.44/5变异株

马玉楠，邹丽容，梁源浩，刘泉汛，孙倩，庞玉莲，林洪青，邓小玲，唐时幸，3

1南方医科大学公共卫生学院流行病学系，广东广州 510515；2广东省疾病预防控制中心病原微生物研究所，中国医学科学院广东省新发传染病防治工作站，广东广州 511430；3南方医科大学南方医院感染科，广东广州 510515

随着严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）感染持续流行，SARS-CoV-2不断变异，影响病毒的毒力、传播力，逃避宿主的免疫保护力，严重影响疫情防控。根据其病毒生物学性能的不同以及对疫情的影响，世界卫生组织将SARS-CoV-2变异体分为需要关注的变异体（VOC）、有意义的变异体（VOI）以及需要监控的变异体（VUM）［1］。2021年11月26日，WHO将在南非出现的变异体命名为奥密克戎变体（B.1.1.529），成为SARS-CoV-2 第5个关注的变体［2］。截至2022年12月，SARS-CoV-2奥密克戎变异体已进化为7个不同的亚系，包括BA.1、BA.2、BA.3、BA.4和BA.5［3］以及新变异体BQ.1、BQ.2等［4］。近来，奥密克戎BA.4和BA.5变异株在世界多个地区迅速流行［5］，BA.5超过了BA.2变异株成为全球主要毒株［6］。2022年5月12日，欧洲疾病预防和控制中心（ECDC）将BA.4和BA.5变异株从感兴趣的变体（VOI）重新归类为受关注的变体（VOC）［7］。与BA.2变异株相比，BA.4 和BA.5 显示出更高的传播性和更强的的免疫逃逸能力［8］。2022年6月7日，WHO在其SARS-CoV-2变异跟踪系统中增加了一个新类别，即VOC谱系监测（VOC-LUM），旨在向全球公共卫生服务机构通报需要优先关注和监测的VOC谱系和亚谱系［9］。因此，快速筛查和监测SARS-CoV-2新变异体的传播，对于控制新冠肺炎大流行和及时调整疫苗接种策略至关重要。

SARS-CoV-2 变异株的鉴定主要依赖基因组测序，然而测序方法耗时，成本高，不适合开展常规的大样本检测。近年来CRISPR-Cas基因编辑技术被广泛运用于分子诊断领域，是新一代核酸检测方法［10,11］。2017年张锋团队创建了等温扩增技术结合Cas13a 的SHERLOCK 检测方法（Specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking）检测寨卡病毒和登革热病毒亚型［12,13］。2018年Doudna团队将Cas12a和等温扩增系统结合建立了DNA核酸内切酶靶向CRISPR反式报告方法（DETECTR），可以在常温下快速、特异地检测靶标HPV16和HPV18基因型［14］。2018年李诗渊等人报道了以PCR为前扩增技术的Cas12a分子检测方法（HOLMES），实现单碱基多态性（SNP）分析［15］。目前，已经开发出了基于CRISPR-Cas 平台来检测SARSCoV-2的方法，能够快速检测SARS-CoV-2变异体［16,17］。我们实验室建立了CRISPR-Cas12a检测系统，可以特异性快速检测SARS-CoV-2变异体［18,19］。其中，采用基于逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和CRISPRCas12a相结合的新冠病毒检测系统，可以检测病毒刺突蛋白特征性突变（K417N/T、L452R/Q、T478K、E484K/Q、N501Y 和D614G）以区分SARS-CoV-2 的alpha、beta、gamma、delta、Omicron等SARS-CoV-2 主要变异体。随着Omicron新变异体的不断出现和在全球流行，需要快速检测新冠病毒变异株的即时核酸检测方法［20-22］。目前尚无相关研究结果以F486V位点的特征突变建立CRISPR-Cas12a检测新冠病毒的方法来鉴定和区分奥密克戎最新变异株BA.4/5。在本研究中我们构建了一种基于RT-PCR/CRISPR-Cas12a 检测目前流行的新冠变异株奥密克戎BA.4/BA.5的方法。

1 材料和方法

1.1 SARS-COV-2临床样本采集

本研究共纳入43份SARS-CoV-2核酸阳性临床样本。这些样本是从2021 年12 月～2022 年6 月确诊COVID-19的患者中采集的咽拭子标本，在广东省疾病预防控制中心实验室保存。经RT-qPCR检测orf1a/b和N基因阳性，并通过Sanger测序进行了序列分型。同时收集了相关样本的人口学数据，包括年龄、性别和地区等，但没有患者身份信息（表1）。此外，在新冠肺炎大流行之前收集的感染11种呼吸道病原体，即SARS-CoV-2阴性的20份临床样本被用作阴性对照，用于评估检测方法的特异性。这些呼吸道病原体包括常见的人类冠状病毒（HCoV）229E、OC43 和HKU1，以及鼻病毒（HRV）、腺病毒（ADV）、呼吸道合胞病毒（RSV）A和B、人博卡病毒（HBoV）、人偏肺病毒（HMPV）和人副流感病毒1（HPIV-1）和4（HPIV-4）。参与本研究的所有受试者均提供了知情同意书。

1.2 主要试剂材料及仪器

奥密克戎BA.1和BA.4/BA.5质粒合成、DNA聚合酶、和High-Fidelity Master Mix 核酸扩增试剂均（Tsingke Biotechnology）；pET-28a（+）质粒、QIAampViral RNA Mini Kit（Qiagen Biotech）；miRNeasy Serum/Plasma Kit（TransGen Biotech）；PUC57质粒、探针合成自（Sangon Biotech）；通用型DNA纯化回收试剂盒（Tiangen Biotech）；NEB uffer2.1、DNase I 和HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit 均（New England Biolabs）；NanoDrop 2000分光光度计、BCA蛋白质定量试剂盒均（Thermo Fisher Scientific）；LbCas12a分别（New England Biolabs）和（Bio-lifesci）；便携式蓝光检测仪（Sangon Biotech），荧光定量PCR检测仪（Qitian 基因）；qPCR 试剂盒（武汉明德生物科技）。

1.3 Cas12a蛋白纯化

氨基酸球菌属（Acidaminococcus sp.）AsCas12a酶基因被克隆到表达载体pET-28a(+)并转化到DE3感受态细胞中表达AsCas12a 蛋白。表达的蛋白质在HisTrap HP柱上纯化，洗脱的蛋白质储存在缓冲液中（600 mmol/LNaCl、5%甘油、2 mmol/LDTT、50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5）。然后使用BCA蛋白质测定试剂盒进一步定量纯化蛋白质的浓度，纯化后蛋白质在-80 ℃下储存。

1.4 SARS-CoV-2质粒和病毒RNA

SARS-CoV-2刺突蛋白（S）的全长基因组片段分别基于中国武汉分离的SARS-CoV-2 的野生型毒株（nt 21，563-25，384，NCBI 登录号MN908947）、奥密克戎BA.1 变异体（nt 21，497-25，309，NCBI 登录号OL672836）以及奥密克戎BA.4/BA.5 变异体（nt 21，257-25，360，NCBI 登录号ON780120）由擎科生物科技公司合成，并以pUC57为载体构建新冠病毒刺突蛋白的全长基因组重组质粒,作为建立CRISPR-Cas12a 检测方法的模板（表2）。SARS-CoV-2 靶序列包括奥密克戎BA.1和BA.4/5 S蛋白包括以下突变：T19I、L24S、del25/27、del69/70、G142D、V213G、G339D、S371F、S373P、S375F、T376A、D405N、R408S、K417N、N440K、L452R、S477N、T478K、E484A、F486V、Q498R、N501Y、Y505H、D614G、H655Y、N679K、P681H、N764K、D796Y、Q954H、N969K。使用NanoDrop 2000分光光度计对重组质粒DNA进行定量，使用以下公式计算质粒拷贝数：质粒拷贝数（copies/μL）=[6.02×1023×质粒浓度（ng/μL）×10-9]/（质粒长度×660）。

1.5 PCR引物和特异性crRNA的设计与合成

我们从GenBank数据库下载了来自不同国家或地区的SARS-CoV-2 野生型、突变型（包括奥密克戎亚系BA.1、BA.2和BA.4/5变异体）的刺突蛋白基因序列，并运用MEGA（6.0 版本）软件进行了序列比对分析。比对结果发现刺突蛋白第486 位点F/V突变可以区分BA.4/5与alpha、beta、delta和omicron BA.1变异体，因此选择F486V位点的特征突变以建立CRISPR-Cas12a检测方法。与其他SARS-CoV-2变体不同，奥密克戎在潜在的crRNA靶序列内具有多个突变，这使得使用一个或两个特异性crRNA检测和区分奥密克戎感染成为可能。此外，由于目标序列5′端富含T的原型间隔区相邻基序（PAM）对于Cas12a蛋白的激活是必需的，我们在奥密克戎BA.4/5变异体原始序列里找到了富含T的原型间隔区相邻基序序列。本研究设计了7个奥密克戎特异性crRNA（6个内含次优PAM序列和1个传统PAM序列），即crRNA-1至crRNA-7以覆盖奥密克戎BA.4/5 F486V特异性突变（图1）。

图1 crRNA的设计和选择Fig.1 Design and selection of crRNAs.The schematic graph shows the sequences and positions of the 7 crRNAs with specific mutations (red) and the suboptimal protospacer adjacent motif PAM (blue)within SARS-CoV-2 spike gene.

为了制备crRNA，本研究合成了含有T7启动子、保守的干环茎环序列、靶标特异性序列的单链DNA寡核苷酸及其反向互补链，在95 ℃下变性10 min，并以2 ℃/min的速率降温后取出。从退火产物中用天根通用DNA纯化回收试剂盒回收并纯化双链DNA，然后用NanoDrop 2000 分光光度计定量DNA 浓度，保存于-20 ℃。随后，以退火纯化后产物作为样本DNA，使用HiScribe T7高产RNA合成试剂盒，进行体外转录。转录产物在37 ℃用4个单位的DNase I处理40 min，然后使用miRNeasy血清/血浆试剂盒纯化RNA。最后，使用NanoDrop 2000分光光度计定量crRNA的浓度。引物和crRNA序列见表1，所有寡核苷酸都是由睿博兴科生物技术有限公司合成。

表1 特异性crRNA序列与引物序列Tab.1 Specific crRNAsequence and primer sequence

此外，我们设计靶向SARS-CoV-2刺突基因保守序列的PCR引物。为了确保引物能够扩增不同新冠病毒序列，从NCBI GenBank数据库下载来自不同地区的不同变异体的SARS-CoV-2 基因组序列，使用MEGA软件对多个SARS-CoV-2基因组序列进行了比对分析，并通过NCBI Primer-BLAST评估验证我们设计的引物的特异性。本研究设计筛选了1对PCR引物用以扩增靶序列模板和临床样本cDNA（表2），正向和反向引物的长度为28～34个核苷酸，退火温度为54～67 ℃、预期扩增子大小为647～712 bp。

表2 RT-PCR扩增质粒DNA模板的引物序列Tab.2 PCR primer sequences for SARS-CoV-2 S gene

1.6 基于RT-PCR/CRISPR Cas12a 的SARS-CoV-2 变异体检测方法

如图2所示，本研究使用QIAamp Viral RNA Mini Kit从口咽拭子样本中提取病毒RNA；通过逆转录PCR（RT-PCR）对RNA 模板扩增靶核酸序列，使用oligo（dT）和随机引物将RNA模板逆转录为cDNA，并使用SARS-CoV-2特异性引物通过PCR进行扩增。PCR反应体系为，26 μL High-Fidelity Master Mix、1 μL正向和反向引物（10 μmol/L）和2 μL靶标模板混合。PCR反应程序设置为98 ℃预变性2 min，然后98 ℃变性10 s，55 ℃退火15 s和72 ℃延伸30 s，共40个循环，4 ℃保存。模板预扩增后，将自制的150 nmol/LAsCas12a与1000 nmol/L crRNA在1×NEB缓冲液2.1中37 ℃反应10 min，形成crRNA-Cas12a复合物，然后添加2 μL靶标cDNA扩增产物和400 nmol/L报告探针（5'-端修饰有6-FAM 基团，3'-端修饰有BHQ-1淬灭基团，序列为：5'-TTATT-3'），37 ℃孵育。最后，用荧光定量检测仪测量荧光信号或在便携式蓝光仪下用肉眼判断结果。

图2 PCR/CRISPR-Cas12a介导的测定流程图Fig.2 Workflow of RT-PCR/CRISPR-Cas12a assay for SARS-CoV-2 variant detection.The viral RNA is extracted from oropharyngeal swab samples infected with SARS-CoV-2,reverse-transcribed into cDNA by using Oligo (dT) and random primer,then amplified using SARS-CoV-2 specific primers through PCR.After amplification,Cas12a was pre-incubated with Omicron-specific crRNA-1 and crRNA-2 to form crRNA-Cas12a complex followed by addition of the amplified product and ssDNA probe (5′-6-FAM-TTATT-BHQ-1-3').For the BA.4/5 template,the ssDNA probe was trans-cleaved by the activated Cas12a to release fluorescence signal while no fluorescence signal was released in the reaction of non-BA.4/5 strain.Finally,the fluorescence signal was measured using a fluorescent detector or observed by naked eyes.The detection results are presented as red line or green tube(positive)or as black line or transparent tube(negative).

1.7 统计学分析

使用IBM SPSS 软件第26 版和GraphPad Prism 9.0 版软件进行数据分析。单因素方差分析用于分析所检测到的在靶和脱靶模板之间荧光值的差异，Dunnett's检验用于多重比较和矫正P值。计算受试者操作特征曲线（ROC）和ROC 曲线下面积（AUC）以评估CRISPR-Cas12a检测方法的性能，同时根据约登指数估计临界值；根据kappa 值计算CRISPR-Cas12a方法与Sanger测序方法之间的符合率。P＜0.05 时认为差异具有统计学意义。本研究所有的实验均独立重复3次，实验结果使用GraphPad Prism 9.0 版软件绘图。

2 结果

2.1 筛选CRISPR-Cas12a 检测方法所需要的特异性crRNA

图3 所示，结果显示，本研究所设计的7 条针对BA.4/5的crRNA中，5条crRNA（crRNA-1、2、3、6、7）均能特异性剪切BA.4/5质粒DNA产生荧光，且荧光信号强度随反应时间延长而增强，呈现线性关系。其中crRNA-1和crRNA-2参与的反应中，阴性对照的本底荧光值最低，与BA.1 质粒模版所产生的荧光值相似，而BA.4/5阳性质粒在60 min时产生的荧光值介于15 000～30 000（图3A、B）。crRNA-3和和crRNA-7参与的反应中，BA.4/5阳性质粒与BA.1阴性质粒的荧光比值较低（图3C、G），尤其是和crRNA-6参与的反应中，阴性对照的本底荧光值较高，且BA.4/5阳性质粒与BA.1阴性质粒的荧光比值很低（图3F），不能很好区分BA.1和BA.4/5质粒。相反，crRNA-4和crRNA-5参与的反应中，BA.4/5阳性质粒的荧光值低于BA.1阴性质粒的荧光值（图3D、E），不能用于检测BA.4/5质粒。结果显示不同crRNA产生的荧光信号有很大差别，crRNA-1和crRNA-2区分BA.4/5和BA.1质粒模板的效果更好。

图3 CRISPR-Cas12a检测方法中SARS-CoV-2 BA.4/5特异性crRNA的检测性能比较Fig.3 Comparison of the crRNA specific to SARS CoV-2 BA.4/5 variants in CRISPR-Cas12a assay.The fluorescence was measured at different time points using SARS-CoV-2 plasmid DNAs of Omicron BA.1 (106 copies/μL) and BA.4/5 (106 copies/μL)variants.Different 486V-specific guide RNAs crRNA-1(A),crRNA-2(B),crRNA-3(C),crRNA-4(D),crRNA-5(E),crRNA-6 (F),and crRNA-7 (G) were prepared for PCR followed by detection of CRISPR-Cas12a-mediated assay.Omicron BA.4/5 and BA.1 template are labeled in red and green,respectively.The fluorescence values represent the mean±standard deviation(SD)of 3 replicates.Not input indicates negative control with no plasmid DNA.

2.2 PCR/CRISPR-Cas12a方法的检测限和特异性

crRNA-1、crRNA-2和crRNA-7的荧光信号强度与奥密克戎BA.4/5质粒模板的浓度成正比，crRNA-1、2和7参与的反应中，检测10 copies的BA.4/5模板产生的荧光信号强度明显高于106copies的BA.1模板以及阴性对照管的荧光强度，差异具有统计学意义（P＜0.0001，图4A～C）。此外，在便携式蓝光仪下，BA.4/5阳性质粒呈深绿色，而BA.1阴性质粒和阴性对照管呈淡绿色或者灰色，区分效果很明显（图4D）。

图4 PCR/CRISPR-Cas12a方法的最低检测限（LOD）Fig.4 Limit of detection (LOD) of PCR/CRISPR-Cas12a assay.A series of 10-fold diluted synthetic SARS-CoV-2 plasmid DNAs of Omicron BA.4/5(101-106 copies/μL)and mutant BA.1(106 copies/μL)were used as the templates for PCR followed by the detection of CRISPR-Cas12a-mediated assay.The lower limit of detection was determined and quantitatively analyzed for crRNA-1 (A,E),crRNA-2 (B,F),and crRNA-7(C,G).The testing results were observed by naked eyes under blue light at 30 min after reaction(D).Omicron BA.4/5 and BA.1 template are labeled in red and green,respectively.The fluorescence values represent Mean±SD of 3 replicates.One-way ANOVA and Dunnett's multiple comparisons test were used to analyze the difference between Omicron BA.1 and BA.4/5 template and to adjust P values in Fig.4E,F,G.*P＜0.05;**P＜0.01;****P＜0.0001;Not input,negative control with no plasmid DNA.

评估本研究RT-PCR/CRISPR-Cas12a检测方法的特异性，上述筛选出的奥密克戎特异性crRNA-1 和crRNA-2分别检测20份感染11种常见呼吸道病原体的临床样本，其中包括人冠状病毒（HCoV）229E、HCoVOC43和HCoVHKU1，以及鼻病毒（HRV）、呼吸道合胞病毒（RSV）A和B、人偏肺病毒（HMPV）、人副流感病毒（HPIV-1和HPIV-4）、人腺病毒（AdV）和人类博卡病毒（HBoV），实验结果均为阴性，而同时设定的BA.4/5阳性质粒产生很强的荧光信号（图5A、B）。结果显示本研究设计的两个奥密克戎特异性crRNA特异性高，与其他种常见呼吸道病原体无交叉反应。

根据Sanger测序分型的结果包括野生株（4份）以及Alpha变异株（4份）、Beta变异株（4份）、Delta变异株（6份）以及25份感染奥密克戎变异体（5份BA.1、5份BA.4和15份BA.5）。如图5C、D所示结果均为阴性，而同时设定的BA.4/5阳性质粒产生很强的荧光信号（图5C、D），进一步验证了本检测方法的特异性。

图5 RT-PCR/CRISPR-Cas12a方法检测SARS-CoV-2阳性临床样品和阴性对照Fig.5 Detection of Omicron variants using CRISPR-Cas12a mutation-specific assay.Fluorescence was measured at different time points using 106 copies/ml plasmid DNA of SARS-CoV-2 Omicron BA.4/5 as the template.Assay specificity was validated with nucleic acid samples of common human coronavirus(HCoV)229E,HCoV OC43,and HCoV HKU1,rhinovirus(HRV),adenovirus(ADV),respiratory syncytial virus (RSV) A and B,human bocavirus (HBoV),human metapneumovirus (HMPV),human parainfluenza virus(HPIV-1 and HPIV-4)and Mycoplasma pneumoniae,as well as HIV-1,HBV,HCV（A,B）.A total of 23 SARSCoV-2 positive clinical samples in a panel of 4 wild-type strains,4 alpha variants,4 beta variants,6 delta variants,and 5 Omicron variants were detected by the RT-PCR/CRISPR-Cas12a-mediated assay using crRNA-1 and crRNA-2,respectively(C,D).The mean value of fluorescence of 3 independent experiments is presented.Not input indicates negative control of no plasmid DNA.

2.3 RT-PCR/CRISPR-Cas12a方法的检测性能

荧光强度热图（图6A）显示，crRNA-1的荧光信号比crRNA-2强，在便携式蓝光照射后（图6B），肉眼可判断Omicron BA.4/5阳性样本产生的绿色荧光。而在检测20份感染11种常见呼吸道病原体的阴性对照临床样本时，结果均为阴性，BA.4/5阳性质粒产生很强的荧光信号（图6C）。crRNA-1和crRNA-2检测临床样本的终点荧光值散点图显示，BA.4/5临床样本的荧光信号均在20 000 以上，而阴性对照样本的荧光信号则很明显的可以与之区分开来（图7A、B）；两种crRNA 鉴别新冠Omicron BA.4/5样本方法的ROC曲线下面积分别为0.9989 和1.0，说明我们的诊断方法价值高（图7C、D）。根据ROC 曲线确定crRNA-1 和定crRNA-2 检测的荧光信号临界值分别为21 273 和15 508，能够很好的区分BA.4/5和非BA.4/5样本，差异具有显著性统计学意义（P＜0.0001，表3）。与Sanger测序结果相比，基于crRNA-1和crRNA-2检测方法的灵敏度分别为97.83%和100%；特异性均为100%；Kappa值分别为0.928和0.964，检测方法与测序结果有很高的符合率（表3）。

表3 RT-PCR/CRISPR-Cas12a方法与Sanger测序的检测效果比较Tab.3 Comparison of the results of RT-PCR/CRISPR-Cas12a assay and Sanger sequencing

图6 RT-PCR/CRISPR-Cas12a方法检测SARS-CoV-2阳性和阴性临床样品Fig.6 Testing results of SARS-CoV-2-positive clinical samples and negative controls detected by RT-PCR/CRISPR-Cas12a assay.A:Atotal of 43 SARS-CoV-2 positive clinical samples in a panel of 4 wild-type strains,4 alpha variants,4 beta variants,6 delta variants,and 25 Omicron variants were detected by RT-PCR/CRISPR-Cas12a-mediated assay using two different crRNAs,crRNA-1 and crRNA-2.B:The testing results of BA.4/5 clinical samples were visualized by naked eyes under blue light at 30 min after reaction.C:The DNA plasmid of SARS-CoV-2 S gene was used as positive control,while SARS-CoV-2 negative clinical samples infected with common human coronavirus(HKU1,229E,and OC43),respiratory syncytial virus(RSV)Aand B,parainfluenza virus(HPIV)1 and 4,rhinovirus(HRV),adenovirus(AdV),human bocavirus(HBoV),and human metapneumovirus(HMPV)were used as negative controls to validate the specificity of our assay.No input refers to negative control.The sample ID is presented at the left of the panel.The corresponding fluorescence values were displayed in colors.The scale bar shows the range of fluorescence values while the color change from blue to red represented the increased strength of signals.

图7 RT-PCR/CRISPR-Cas12a方法检测SARS-CoV-2阳性或阴性临床样品结果Fig.7 Diagnostic performances of RT-PCR/CRISPR-Cas12a-mediated assay.A total of 43 SARS-CoV-2-positive clinical samples and 20 SARS-CoV-2-negative clinical samples were detected by RT-PCR/CRISPR-Cas12a assay using two different crRNAs,crRNA-1 and crRNA-2.The detection data are presented as scatter plots for cdRNA-1 (A) and crRNA-2 (C) while the corresponding fluorescence values of Omicron BA.4/5 samples and negative control are labeled in red and blue,respectively.The error bar represents the Mean±SD.The receiver operating characteristic(ROC)curves for crRNA-1(B)and crRNA-2(D)were included.

3 讨论

早期检测、早期发现、及时追踪和隔离新冠病毒感染者，仍然是控制新冠疫情扩散的有效措施。我国在新冠疫情发生后，快速获得了新冠病毒的全基因组序列，研发了检测新冠病毒的核酸检测试剂。截止2022年9月，中国药品监督管理局已经审批通过了41个新冠病毒核酸检测试剂、34个新冠病毒抗原检测试剂和39个新冠病毒抗体检测试剂［23］。美国FDA也于2020 年2月4日给予新冠病毒核酸检测试剂紧急使用授权，截至2022 年5月5日共有307个紧急使用授权SARS-CoV-2分子检测试剂和48个抗原检测试剂［24］。但是，随着越来越多的新冠病毒变异体的增多，且这些变异体获得了新的表型，有着不同的传播性、致病性和免疫原性等生物学特性。部分变异体有更强的传播能力、变化的毒力和致病力，导致免疫逃逸、漏检等增加了疫情防控的复杂性和严重性［25-27］，亟需对当地SARS-CoV-2主要流行变异体进行鉴定，以提出针对性的疫情防控措施，控制病毒传播和大流行。

奥密克戎变异体的出现和持续传播给疫情防控带来了巨大的威胁和负担，及时诊断奥密克戎变异体并监测其流行趋势非常重要。病毒全基因组测序仍是鉴定SARS-CoV-2变异体的金标准方法，然而，该方法成本高、耗时长，不适合对SARS-CoV-2变异株进行常规基因分型。因此，迫切需要一种快速、经济高效的检测方法来筛查奥密克戎变异体。在我们之前的研究中将传

统的RT-PCR与CRISPR基因编辑技术结合，建立了检测新冠病毒主要变异体的方法［28］，进而将核酸等温扩增方法与CRISPR技术结合，实现室温下在同一检测管中检测SARS-CoV-2变异体,开发了检测奥密克戎变异体BA.1的方法［18］。

迄今为止，运用PCR检测一个或多个靶标进行新冠病毒变异株鉴定主要有两种策略：等位基因特异性PCR和溶解曲线分析［29,30］。其中，Aoki等［31］根据新冠病毒奥密克戎刺突蛋白的F486V突变，结合高分辨率熔融法建立了快速鉴定BA.5临床样本的检测方法，通过编码RNA 片段溶解曲线分析可以区分BA.1、BA.2 和BA.5亚型。Yan等［32］采用多重PCR策略，开发了针对奥密克戎32 个突变位点的多重微测序检测方法（MeltArray），该方法在2.5 h内能够检测BA.1、BA.2、BA.3、BA.4/5变异株，检测限为50 copies/反应。研究显示逆转录重组聚合酶扩增（RT-RPA）结合CRISPRCas12a检测新冠病毒变体的酶促反应方法，针对目前的关键突变体Alpha、Beta、Gamma、Delta、Lambda、Mu、Kappa、Omicron 及其子变体BA.1、BA.2、BA.3、BA.4和BA.5，可在70 min内完成高通量即时检测，但没有使用BA.4和BA.5的临床样本进行验证［33］。本研究中，我们通过新冠病毒刺突蛋白基因序列分析，找到可以区分奥密克戎变异体BA.4/5与BA.1的F486V特异性突变，建立了快速检测和区分奥密克戎BA.4/5变异体的RT-PCR/CRIPSPR-Cas12a检测方法，可以明显区分SARS-CoV-2奥密克戎BA.4/5变异体，检测限达到10 copies/反应，满足临床检测需求。研究表明，大多数SARS-CoV-2阳性样本的病毒滴度在104～108copies/反应之间［34-36］，提示我们的检测适用于检测大多数临床样本，且检测时间短，操作简单，检测限低。通过检测人常见呼吸道感染病原体阳性样本以及感染新冠病毒不同变异体的阳性样本，证实该方法的敏感性和特异性均＞97%，为检测SARS-CoV-2奥密克戎BA.4/5变异体提供了新的工具和方法。

本研究的另一个创新是对CRISPR-Cas12a检测系统中起重要作用的crRNA进行了优化和筛选。crRNA与靶序列的特异性结合是激活Cas12a酶剪切荧光探针活性并释放荧光信号的基础，其中PAM序列发挥重要作用。通过修改传统PAM（TTTV）获得一些次优PAM（VTTV，TTVV，TCTV），可以增强CRISPR-Cas12a反应的效率，提高检测结果的敏感性［37］。本研究中，我们设计了7条具备不同PAM序列的crRNA，结果证实次优PAM基序与crRNA序列的不同组合是决定检测结果和影响反应的重要因素，这些研究结果也为后续CRISPR-Cas12a检测的优化和改进提供了实验数据。

总之，我们成功开发了一种RT-PCR/CRISPRCas12a检测方法，可以有效提高奥密克戎变异体基因分型能力。我们建立的检测分型系统是一个简单实用的检测工具，不需要复杂的实验室条件即可监测和跟踪正在传播的奥密克戎变体流行动态。尽管初步评估结果显示CRISPR-Cas12a检测方法较好的检测性能，后期仍然需要大量临床样本来进一步验证和优化该方法。我们也将进一步采用等温扩增技术与CRISPRCas12a技术结合，从而简化检测步骤，降低成本，建立现场快速新冠病毒变异体核酸的检测与分型方法。