基于氧化亚铜纳米颗粒的光热//化学动力协同策略体外抑制胃癌细胞的迁移

温海飞，黄显莹

南方医科大学南方医院第一临床医学院，广东 广州 510515

胃癌（GC）全球每年新发病例数超百万，而其中中国患者约占半数［1,2］。我国80%胃癌患者在确诊时已是进展期以及晚期［3］，针对此类患者而言，以铂类和氟尿嘧啶类药物为基础的联合化疗是首选的一线治疗方案。尽管其研究工作取得了重大的进展，但传统辅助化疗治疗选择仍然有限、毒副作用大，目前总体5年生存率不足50%［4］。寻找一种既能提高疗效又能避免传统辅助化疗带来的毒副作用的新型治疗方案，是目前突破胃癌治疗瓶颈的关键。

光热疗法（PTT）是利用近红外光（NIR）的光热转换作用，在无创的情况下通过热效应诱导肿瘤细胞死亡［5］。NIR不仅可以直接引起肿瘤细胞死亡，同时可更为精准地促进药物的释放［6］。除此以外，研究证实在低于42 ℃的条件下进行热疗可增加肿瘤区域的血流灌注，从而提高药物的有效浓度、增强药物的细胞毒性［7,8］。光热疗法与化疗相结合有望成为一种新型、有效的胃癌治疗方案。铜基金属纳米材料，如铜纳米颗粒（Cu NPs）、硫化铜（CuS）、硒化铜（Cu2Se）、氧化铜（CuO）等，其光热转换率高，介导的类芬顿反应可催化肿瘤微环境（TME）中的过氧化氢（H2O2）产生过量的羟自由基（•OH），从而重塑肿瘤相关微环境、诱导肿瘤细胞的死亡［9-11］，在乳腺癌、前列腺癌、恶性胸膜间皮瘤等治疗中取得了一定的疗效［12］。其中氧化亚铜（Cu2O）作为一种稳定的铜基纳米药物，在黑色素细胞瘤、膀胱癌、宫颈癌细胞系中已被证实可通过产生活性氧（ROS）促进相关的肿瘤细胞凋亡［13-15］，但其用于胃癌的治疗却鲜有报道。基于此，本研究制备了Cu2O，探索了其物化表征以及在胃癌细胞系中的抗肿瘤效应，旨在初步探索Cu2O是否可通过光热/化学动力协同作用在胃癌中起到疗效。

1 材料和方法

1.1 Cu2O纳米颗粒的合成

85 mg二水氯化铜（CuCl2-2H2O）与300 mg 聚乙烯吡咯烷酮（PⅤP，MW=6000）放在20 mL去离子水中以600 r/min搅拌1 h，随后加入320 mg NaOH搅拌溶解。将上述溶液置入氮气环境，逐渐加入176 mg抗坏血酸继续1000 r/min搅拌1 h。经过去离子水以10 000 r/min反复洗涤，离心3次，随后在50 ℃真空干燥24 h后，得到30 mg氧化亚铜（Cu2O）。

1.2 Cu2O纳米颗粒的形态大小

收集Cu2O纳米并适当稀释样品溶液后，用移液枪吸取10 μL样品滴加在镍网上。室温放置至溶液蒸发后，用离子溅射仪镀上导电金膜，在200 kⅤ的加速电压下，采用TEM观察纳米复合物的形貌特征（JeolJem-2100f TEM透射电镜仪），并利用动态光散射原理测定Cu2O纳米颗粒的粒径和电势。

1.3 Cu2O纳米颗粒的光热功能

收集成功合成的Cu2O纳米，并按一定比例进行适当稀释后，取不同浓度（20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL）的200 μL稀释后的溶液加入到1.5 mL的EP管中（其中PBS作为阴性对照）。将样品及激光仪（LR-MFJ-1064/5000；Bruke）固定后，打开近红外（808 nm）激光仪光源对样品进行照射（0.5 W/cm2，5 min），并通过红外探测仪（Tensor 27 FT IR spectrometer;Bruke）进行拍照分析温度变化水平，绘制升温曲线。

1.4 Cu2O纳米颗粒的化学动力功能

利用选择性•OH捕获后亚甲基蓝（MB）降解的经典比色法，在PBS（pH=6.5）中加入4 mmol/LH2O2的MB溶液（10 μg/mL），在不同温度条件下（37 ℃和45 ℃），加入不同浓度的Cu2O 纳米颗粒（0、20、40、60 μg/mL），检测其λ=664 nm 的吸光度，用于检测不同浓度材料的•OH生成量，即类芬顿效果。

1.5 细胞培养

使用含10%胎牛血清的DMEM培养基、置于37 ℃5%CO2培养箱中进行胃癌细胞（AGS 及MKN45）培养。每24 h更换1次培养基，细胞密度超过70%时，以0.25%胰酶消化进行传代培养。

1.6 激光共聚焦实验

将胃癌细胞（AGS及MKN45）铺板于细胞培养板贴壁后，在每个微孔中加入不同浓度的Cu2O纳米进行孵育，并进行光照或者非光照处理，继续放置在孵育箱中培养24 h。最后用活性氧试剂盒染色、细胞核DAPI染色，再用激光共聚焦进行拍照。

1.7 CCK-8细胞毒性实验

将胃癌细胞（AGS及MKN45）铺板于细胞培养板贴壁后，在每个微孔中加入不同浓度的Cu2O纳米（0、2、4、16、32以及64 μg/mL）进行孵育，并进行光照或者非光照处理，继续放置在孵育箱中培养24 h；然后，去除培养基、并在每个待测微孔中加入100 μL预先配置好的10%CCK-8试剂；最后，用酶标仪测定每个测量孔在450 nm处吸光度，并记录结果进行对比分析，24 h后用CCK-8检测试剂盒处理，并用酶标仪检测吸光度间接判断细胞存活率。

1.8 Transwell细胞迁移实验

将胃癌细胞（AGS及MKN45）铺板于细胞培养板贴壁后，利用不同浓度的Cu2O纳米（16 μg/mL）进行孵育，并进行光照或者非光照处理，24 h后去除培养基、胰酶消化重悬并收集细胞。用无血清培养基重悬细胞，按2×105/100 μL加入至Transwell上室，下室加500 μL含20%FBS的DMEM培养液，培养48 h后取出小室，棉签拭掉上室内侧细胞，4%多聚甲醛固定细胞，0.5%结晶紫溶液染色，显微镜下选取5个视野进行拍照、计数。

1.9 统计学分析

所有数据均采用IBM SPSS 20.0处理。计数资料比较则采用卡方检验。采用Kaplan-Meier法进行生存分析，并用Log-rank检验比较组间差异。以α=0.05为检验水准，对以上结果均进行双侧检验。

2 结果

2.1 Cu2O纳米颗粒的形貌

本实验成功制备Cu2O纳米颗粒，透射电镜图可见Cu2O纳米颗粒是约为100 nm的光滑圆球形（图1A）。对Cu2O纳米颗粒的水合粒径及Zeta电位进行分析，经由马尔文粒径仪测得，Cu2O纳米的平均Zeta电位为30±2.4 mⅤ，而其水合平均粒径为84±14.1 nm（图1B、C）。

图1 氧化亚铜(Cu2O)纳米颗粒的理化性质Fig.1 Physical and chemical properties of Cu2O nanoparticles.A: Morphology of Cu2O nanoparticles under transmission electron microscope(TEM).B:Zeta potential of Cu2O nanoparticles.C:Particle size of Cu2O nanoparticles.Data are shown as Mean±SD(n=3).

2.2 Cu2O纳米颗粒的光热性能

在0.5 W/cm2的近红外光照条件下，不同浓度的Cu2O纳米颗粒展现出不同的光热性能，浓度越高，光热效果越强（图2A）。而对于不同功率的近红外光照条件下，随着时间的延长，其温度逐渐升高。其中0.5 W/cm2近红外光照条件下，5 min后，Cu2O纳米系统温度可升高50 ℃（图2B）。

图2 Cu2O 纳米颗粒的光热性能Fig.2 Photothermal properties of Cu2O nanoparticles.A: Photothermal effect of different concentrations of Cu2O nanoparticles.B:Photothermal effect of Cu2O nanoparticles irradiated by near-infrared light with different powers.

2.3 Cu2O纳米颗粒的类芬顿效应

在同样过氧化氢浓度的条件下，不同浓度的Cu2O在37 ℃以及45 ℃条件下，均展示出不同的吸光度，随着浓度的增加吸光度越低。在λ=664 nm条件下，吸光度最高（图3A、B）。在同样过氧化氢浓度的条件下，相比于37 ℃，45 ℃条件下的Cu2O展示出更低的吸光度，温度的升高可提高Cu2O的类芬顿能力。

图3 Cu2O 纳米颗粒的类芬顿效应Fig.3 Fenton-like effect of Cu2O nanoparticles.A:Concentration of•OH produced by different concentrations of Cu2O nanoparticles at 37 ℃.B: Concentration of •OH formed by different concentrations of Cu2O nanoparticles at 45 ℃.

2.4 Cu2O纳米颗粒产生ROS的能力

为进一步评估Cu2O纳米颗粒的活性氧能力，我们将胃癌AGS细胞系以及MKN45细胞系经近红外光照射下（0.5 W/cm2，5 min）后培养24 h后评估其产生ROS的能力。无论是AGS 细胞以及MKN45 细胞，在与Cu2O纳米颗粒共孵育后均可产生ROS。而经近红外光照射下（0.5 W/cm2，5 min）后，AGS细胞何MKN45细胞产生的ROS量明显增加（图4A、B）。

图4 近红外光照射下(0.5 W/cm2，5 min)Cu2O 纳米颗粒在胃癌AGS细胞系以及MKN45细胞系中的活性氧(ROS)生成能力Fig.4 Ability of Cu2O nanoparticles to induce reactive oxygen species (ROS) production in gastric cancer AGS cells and MKN45 cells under 0.5 W/cm2 near-infrared irradiation for 5 min(Original magnification:×100).

2.5 Cu2O纳米颗粒抑制胃癌细胞增殖能力

为进一步评估Cu2O纳米的体外抗肿瘤作用，我们用CCK-8实验评估该纳米复合物的细胞毒性。CCK-8细胞毒性实验结果显示，不同浓度Cu2O纳米颗粒（0、2、4、16、32以及64 μg/mL）处理的AGS及MKN45细胞存活率均呈浓度依赖性降低，具有显著抑制增殖作用。此外，在相同浓度Cu2O纳米颗粒处理下，经近红外光照（0.5 W/cm2，5 mins）的细胞存活率更低（图5A、B）。

图5 Cu2O 纳米颗粒对胃癌AGS细胞以及MKN45细胞活性的影响Fig.5 Effects of Cu2O nanoparticles on viability of gastric cancer AGS cells and MKN45 cells.A: Survival rate of AGS cells treated with different concentrations of Cu2O nanoparticles with or without near-infrared light(0.5 W/cm2,5 min).B:Survival rate of MKN45 cells treated with different concentrations of Cu2O nanoparticles with or without near-infrared light(0.5 W/cm2,5 min).***P＜0.001.Data are shown as Mean±SD(n=3).

2.6 Cu2O纳米颗粒抑制胃癌细胞转移能力

为进一步评估Cu2O纳米的体外抗肿瘤转移作用，我们用Transwell 小室迁移实验分析AGS 细胞以及MKN45细胞迁移潜能水平。相比于空白对照组，Cu2O纳米颗粒处理的胃癌细胞迁移细胞数目明显减少。此外，经近红外光照（0.5 W/cm2，5 min）的细胞迁移能力更低（图6）。

图6 Cu2O 纳米颗粒对胃癌AGS细胞以及MKN45细胞迁移能力的影响Fig.6 Effect of Cu2O nanoparticles on migration of gastric cancerAGS cells and MKN45 cells(×100).

3 讨论

胃癌在我国的发病率仅次于肺癌居第2位，死亡率居第3位，是威胁国民身心健康的重大疾病［1］。目前，进展期胃癌患者治疗主要以根治性切除联合术后辅助化疗为主的综合治疗［16］。但是传统的化疗药物（如奥沙利铂，紫杉醇等）容易引发脱发、恶心呕吐、骨髓抑制等全身多系统毒副作用，还易导致药物化疗耐药，在一定程度上降低化疗药物的抗肿瘤作用［17-19］。因此在本研究中，我们构建了纳米载药平台Cu2O，随后探索了Cu2O纳米颗粒的物化表征，包括其形貌、光热性能以及类芬顿效应。结果表明，与其余铜基纳米材料类似，为一光滑圆球形，具有良好的光子特性［20,21］，包括光热疗法，硫族铜化合物在NIR范围内具有化学计量依赖的局部表面等离子体激元共振（LSPR）吸收［22］，因此，已得到了广泛研究，同时，基于芬顿反应的催化纳米疗法通过转化过氧化氢产生有毒的ROS，传统的铁基纳米试剂芬顿反应的pH低（pH=3～4），反应速度慢（≈63 M-1s-1），在NIR的作用下铜基纳米药物具有更高的芬顿反应速率（≈1×104M-1s-1），反应具有更高的pH范围，所产生的类芬顿效果可产生大量的活性氧用于杀伤肿瘤细胞的氧化应激过程［23］。PTT作为一种侵入性较小、且较为有效的抗肿瘤模式，近年来备受关注［24］。其中，在癌细胞上产生强的光照吸收以及高的光热转换效率是光热疗法能否成功的关键［25］。在纳米材料中，铜基纳米材料对光有很强的表面等离子共振吸收效应，有很强的光热转换效率，可以在局部范围内迅速加热，从而在肿瘤的PTT中具有明显的优越性［26-28］。如在4T1细胞中，QCS/CuSNPs可有效地吸收NIR、产生热效应，进而产生大量的ROS诱导肿瘤细胞凋亡［29］。PTT诱导的热敏化效应（如抑制DNA合成和修复、损伤细胞膜和细胞骨架）可与其他治疗模式之间产生协同作用［30］。

其中，化学动力治疗（CDT）的治疗模式，是指在肿瘤酸性微环境下，细胞中H2O2在金属催化剂存在的前提下，发生芬顿或类芬顿反应并产生大量的•OH，产生的•OH可通过氧化还原反应损伤脂质、蛋白质和DNA等从而引起细胞死亡的一种新型治疗模式［31,32］。单一的CDT 作用难以杀灭肿瘤，需辅以其他的治疗。而PTT以及CDT均具有肿瘤选择性、调节肿瘤微环境等特点，在温度升高的情况下可大大增加化学动力作用，因此，光热治疗联合化学动力治疗是一种新颖且有效的治疗方法［33,34］。文献报道一般是将一种具有光热作用的材料与一种具有化学动力作用的材料相互结合从而达到光热治疗联合化学动力治疗的目［35-37］。选择合适的光敏剂以及CDT反应底物是设计、优化光热联合化学动力治疗的关键。然而，通常来说选择的PTT 以及CDT反应底物为两种不同的纳米材料，涉及到两种材料的结合，因此存在着载体与配体是否能够紧密结合、相互作用比例和两者结合的复合物是否稳定的问题。因此，探索一种既具有光热治疗效果亦具有化学动力效果的纳米复合物尤为迫切。近年来，铜基纳米材料在CDT中蓬勃发展，极大地提高了CDT的效率［38］。铜基纳米材料作为无机纳米材料具有独特的电光声磁性能；同时在制备过程中更易控制和调整其结构、组成、形态和尺寸，因此在多种肿瘤成像和治疗中起到了越来越大的作用［39］。尤其是Cu+，可与H2O2发生类芬顿反应生成大量的•OH，可用于肿瘤的CDT作用。除此以外，铜基纳米材料还具有良好的光热转换能力，可将吸收的NIR有效转换为热能。PTT产生的热能可促进铜参与的类芬顿反应，进而增强铜介导的CDT作用［40,41］。如，PEGCu2Se在乳腺癌的治疗中，可通过介导PTT与CDT的协同治疗，起到比单一的PTT或CDT更佳的抗肿瘤疗效［41］。

在本研究中，我们利用Cu2O的光热转换性能以及类芬顿效应，探讨其在胃癌细胞中的抗肿瘤效应。在我们的前期工作里，已对Cu2O纳米颗粒进行表征，XPS证明了铜元素的价态［42］；在体外实验中，我们证实了Cu2O可在胃癌细胞中产生ROS，而在NIR照射条件下可提高局部温度，继而在高条件下可产生更多的ROS。这表明，Cu2O可在胃癌细胞中引起CDT作用。进一步的，Cu2O在NIR照射下，较于无NIR照射条件下，明显引起了更多胃癌细胞的死亡以及减少了胃癌细胞的迁移，这说明NIR介导的PTT可增加CDT作用。以上结果均表明Cu2O纳米颗粒在胃癌细胞中可通过PTT/CDT协同作用产生ROS，从而抑制胃癌细胞增殖、侵袭与转移，并且与PDT或CDT单一治疗方式相比，具有更高的抑瘤效果。这提示着Cu2O纳米颗粒利用PTT/CDT协同作用产生ROS是一类新型的增强胃癌药物疗效的潜在治疗策略，后续研究可进一步探讨该治疗策略的体内抗肿瘤作用。然而，本研究仍缺少对于PTT/CDT协同作用引起胃癌细胞死亡过程中深层机制的探讨，这仍需我们进一步探索。

综上，本研究中，我们制备了Cu2O纳米颗粒，其具有良好的光热转换能力、类芬顿效应，并初步验证了Cu2O纳米颗粒可通过PTT/CDT协同作用在胃癌细胞中产生大量的ROS，从而介导胃癌细胞死亡以及抗胃癌细胞迁移。