旋毛虫肌幼虫排泄分泌蛋白对脓毒症诱发的小鼠心肌损伤有保护作用

脓毒症是宿主感染病原生物后机体大量释放炎症因子，致使免疫调节失控而引发的全身性炎症反应综合征，可造成感染性休克及多脏器功能衰竭。脓毒症及其诱发的器官损伤已成为严重危害人类健康的棘手难题。作为人体的核心器官，心肌损伤是重症脓毒症最常见的可逆性并发症状，主要体现为左心室收缩和舒张功能障碍。流行病学调研发现，超过半数以上的脓毒症病人会伴发心功能障碍，致使预后变差，病死率达到80%左右，因此，有效防治脓毒症心肌损伤已成为控制疾病进展，改善患者预后的研究重点。

近年来，针对“蠕虫疗法”保护炎症性疾病的研究逐渐增多。蠕虫及其排泄分泌蛋白具有良好的免疫调节活性，可通过诱导多种免疫细胞活化调控宿主免疫应答。这种调控一方面能帮助蠕虫躲避宿主的抗虫免疫打击，营造便于其长久寄生的环境，另一方面又能减轻过度抗虫免疫而引发的组织器官伤害，有利于机体建立免疫耐受。“卫生假说”提出，蠕虫感染率下降对机体免疫系统发育存在负面影响，可加大免疫相关性疾病的患病几率。有文献报道，蠕虫及蠕虫来源蛋白对糖尿病、多发性硬化症、过敏性鼻炎、系统性红斑狼疮、脑脊髓炎及代谢综合征等多种免疫失调性疾病均有保护作用，这种保护作用是多种免疫细胞共同参与调控的结果，例如树突状细胞、调节性T细胞、调节性B细胞和巨噬细胞等，主要表现为抑制白介素6（IL-6）和白介素1β（IL-1β）等炎性因子分泌，并促进白介素10（IL-10）和转化生长因子-β（TGF-β）等调节性细胞因子分泌。另有文献报道，蠕虫排泄分泌蛋白对脓毒症也具有良好的保护作用。本课题组前期研究发现，源自日本血吸虫的半胱氨酸蛋白酶抑制剂Sj-Cys有效缓解了脓毒症诱发的心肌损伤，表明蠕虫衍生蛋白具有保护脓毒症心肌损伤的潜力。

已有文献表明，旋毛虫（）和旋毛虫排泄分泌蛋白可以有效缓解风湿性关节炎、溃疡性结肠炎、哮喘等病变的炎症反应。且有研究发现，旋毛虫排泄分泌蛋白对脓毒症诱发的肝、肾及肺脏损伤均具有保护作用，目前旋毛虫排泄分泌蛋白对脓毒症诱发心肌损伤的影响还未见报道，本实验选用抗炎效果明确的临床脓毒症用药地塞米松作为阳性对照，探讨旋毛虫肌幼虫排泄分泌蛋白Ts-MES对脓毒症心肌损伤的影响，并分析其免疫机制，以期为蠕虫及蠕虫来源蛋白保护脓毒症及其诱发的器官损伤提供理论支持和实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 7～9 周龄雄性BALB/c 小鼠，体质量20～23 g，由河南斯克贝斯生物公司提供。

1.1.2 虫株 安徽省感染与免疫重点实验室昆明鼠传代保种的河南猪源旋毛虫。

1.2 主要试剂和仪器

昌乐火山国家地质公园2013年被住建部确定为国家自然遗产，2014年初被国土资源部确定为国家地质公园。近年来，昌乐县积极开发利用远古火山资源，正在规划建设“两山一带三组团”的旅游产业发展格局，“两山”，即昌乐远古火山地质公园和莲花山农庄小镇，“一带”，即火山乡村旅游带；“三组团”，即西部“古火山小镇”组团、南部山地休闲度假组团、北部现代休闲农业与宗教文化组团。

1.3 实验方法

1.3.1 旋毛虫肌幼虫排泄分泌蛋白（Ts-MES）的收集和鉴定 依照文献［25］的方法富集旋毛虫肌幼虫，将肌幼虫置于不含血清的RPMI 培养基中孵育，48 h后吸取上清，超滤膜予以浓缩，SDS⁃PAGE鉴定蛋白成分，测定蛋白浓度后-80 ℃冷冻保存。

1.3.4 超声心动图评估心功能 术后12 h，依据文献［25］的方式，进行M模超声心动图检测，以乳头肌为参照观察左心室运动状况，记录心率、每搏输出量、收缩期左室内径、舒张期左室内径、收缩期左室容积、舒张期左室容积等指标数据，选取3个连续心动周期取均值计算左室射血分数（LVEF）和左室缩短率（LVFS），以评价左心室收缩功能。血流多普勒模式下分别检测二尖瓣舒张早期血流速度（E）和舒张晚期血流速度（A），选取3个连续心动周期取均值计算E/A比，以评估左心室舒张功能。

1.3.3 实验动物分组及干预 80只雄性BALB/c小鼠随机分为4组，各组20只，分别为假手术组（A组）、心肌损伤模型组（B组）、Ts-MES治疗组（C组）和地塞米松对照组（D组）。B、C、D组经CLP法构建脓毒症心肌损伤动物模型，A组只行开腹探寻，不结扎和穿刺盲肠。术后40 min，A、B两组小鼠腹腔注射150 μL PBS，C组腹腔注射含有20 μg Ts-MES的等量PBS，D组腹腔注射含地塞米松（0.3 mg/kg）的等量PBS，剂量参考文献［24］。每组随机抽取6只小鼠在术后12 h进行超声心动图检测，另随机抽取8只小鼠用于观测72 h生存率，剩余的6只小鼠术后12 h麻醉后收集眼球血和心脏。

1.3.2 脓毒症心肌损伤小鼠模型的构建 利用盲肠结扎穿孔术（CLP）法构建脓毒症心肌损伤小鼠模型。手术前12 h禁食，不禁水。腹腔麻醉后固定四肢，剃除腹部皮毛并消毒，从腹白线处按层次剪开，做一长约1.0 cm的腹部开口，腹腔探查寻找盲肠并轻柔地牵出体外，在距离盲肠末端约0.8 cm处用4-0外科缝线结扎，使用18号穿刺针在已经结扎的盲肠上避开血管进行对穿，轻轻挤出少许粪便后将盲肠复位，按层次缝合腹壁后消毒。每只小鼠术后经皮下注射给予0.5 mL生理盐水增补体液，正常饮食饲养。所有动物实验均按照蚌埠医学院实验动物管理和伦理委员会批准的方案进行，伦理编号：［2021］第189号。

与总体回归结果相同，RTA签订质量对经济增长的推动作用要显著大于RTA数量的作用，且法定承诺率的经济增长效应略大于条款覆盖率的经济增长效应，即RTA的质量比数量更有效，越严格执行协议质量对经济增长的影响效果越大。这其中相对于发展中国家而言，发达国家签订高质量的RTA更能有效推进经济增长。

1.4.1 血清细胞因子的检测 术后12 h，麻醉小鼠后采集血清，参照ELISA试剂盒说明书，分别检测血清中NTPro-BNP、cTnI、TNF-α、IL-6、IL-10和TGF-β的水平。

1.4 标本的采集和检测方法

图3中给出了全仿真运行时序。H1是故障首次发生的点，通常需要4个周期才能清楚主保护断路器的故障。当初级电弧在H2处被消除时，次级电弧电流开始流过故障点。在H4处对次级电弧进行灭弧，两个相在H3处的250 ms（从时间零起）跳闸，即在初级电弧消除之后的10个周期。

首先对于道路桥梁施工图纸进行充分的熟和了解，同时详细的了解伸缩缝施工的操作流程以及需要注意的细节，根据工程施工的实际情况制定出施工方案并报告给相关部分经检查合格之后再进行施工。同时对于施工人员应该明确每一个施工人员的工作任务以及工作责任，将施工中所使用的机械设备进行合理的分配，并对所有设备进行必要的测试，确保可以正常使用，严格对每一道施工工序进行监管，避免出现质量问题。

1.4.2 心肌组织病理学观察 术后12 h进行心脏取材，将取下的心脏置于预冷至4 ℃的PBS液中，在左心耳处剪开，PBS灌洗心腔。剪取心尖部分，石蜡包埋，切片后进行HE染色，镜下观察心肌组织结构变化。参考文献［26］进行心脏组织病理学损伤评分，每例玻片随机选择5个400×视野，根据每个视野下损伤（心肌纤维水肿、变性、坏死及炎细胞浸润）累及范围占总视野百分比计分：0分，无累及；1 分，＜25%；2 分，25%～50%；3 分，50%～75%；4分，＞75%，根据5个视野下损伤评分的均值评价每例样本的心肌损伤程度。

目前，我国乡村旅游电子商务的发展处于自发式发展阶段，缺乏有效的统一战略规划，虽然部分地区对乡村旅游资源的开发开展了规划和设计，但项目难以落地，项目大量存在低质开发、基础设施重复建设、旅游模式与产品模式雷同、破坏乡村环境等不良现象。乡村旅游资源得不到充分挖掘，开发模式缺少地方文化内涵，特色不明显，形成千篇一律的发展模式。

地塞米松磷酸钠（博莱药业，5 mg/mL）；苏木素染色液（Baso）；TNF-α、IL-6、IL-10、TGF-β ELISA试剂盒（达科为）；NTPro-BNP、cTnI ELISA 试剂盒（Elab science）；RNA 逆转录试剂盒（Thermo Fisher）；SYBR预混液及TNF-α、IL-6、IL-10、TGF-β、GAPDH 基因检测上、下游引物（Sangon Biotech）；酶标仪Model550（Bio-Rad）；超声心动图仪Vevo 2100（Visualsonics）；荧光定量PCR仪Light Cycler 96 SW1.1（Roche）。

1.4.3 心肌组织中细胞因子的检测 参照文献［17］利用Trizol法提取心肌组织中的RNA，逆转录成cDNA并进行qRT-PCR检测，比较各组小鼠心肌组织中TNF-α、IL-6、IL-10及TGF-β的表达量。引物设计如表1。

心脏超声心动图检测表明（图3），和A组相比，B组小鼠的LVEF、LVFS、E/A比均显著降低（＜0.001）。和B组相比，C、D两组小鼠心脏的收缩和舒张功都有明显好转，LVEF、LVFS、E/A比均显著升高（＜0.01）。

1.4.4 72 h生存率评估 术后定时观察小鼠的精神、活动和饮食情况，准确记录各时段每组小鼠的生存状况并制作生存曲线。

1.5 统计学方法

实验数据统计采用GraphPad Prism 5软件，全部数据以均数±标准差表示，生存率估计用Kaplan-Meier法，生存曲线比较用Log-rank法，多组数据比较采用one-way ANOVA法，＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Ts-MES的SDS⁃PAGE鉴定结果

A组小鼠术后精神、活动和饮食情况均正常，100%存活；B组小鼠术后萎靡不振，皮毛竖起，角落抱团，不活动或少活动，主动进食极少，72 h生存率为0%；C组和D组小鼠的整体生存状态明显好转，72 h生存率分别为37.5%和50%，相比B组显著上升（＜0.05，图2）。

2.由原来的以审批为重心转向以规则制定为重心。各级监管部门从规范政府采购各方当事人行为出发，陆续制定了一系列具体实施办法和针对本地政府采购工作实际的管理办法。如政府采购工作规程、政府采购项目开标评标现场监督管理暂行办法、政府采购评审专家管理实施办法、政府采购代理机构管理暂行办法等。这些办法都明确了各方当事人不能触碰的红线。例如，自2018年3月1日起实施的《政府采购质疑和投诉办法》，在原有办法规定的基础上增加了供应商虚假、恶意投诉或在全国范围12个月内三次以上投诉查无实据的，由财政部门列入不良行为记录名单。

2.2 Ts-MES对脓毒症心肌损伤小鼠生存率的影响

Ts-MES是含有多种蛋白组分的杂蛋白，在SDSPAGE分离和考马斯亮蓝着色后可见20条蛋白条带，其中主要条带有11条，相对分子质量在10 000～142 000之间（图1）。

2.3 Ts-MES对脓毒症心肌损伤小鼠心功能的影响

阴茎与阴囊、阴阜之间的夹角称为阴茎角，包括阴茎阴囊角和阴茎阴阜角。包茎：阴茎体外显正常，远端包皮外口窄小，无法翻开显露龟头，呈柱状外观，阴茎角为直角。隐匿阴茎：显露不良，阴茎角呈钝角(图2)。包茎和隐匿阴茎两者阴茎体发育均正常，只是显露有差异(图3)。

2.4 Ts-MES对脓毒症心肌损伤小鼠心肌组织结构的影响

HE染色显示（图4），和A组相比，B组小鼠的心肌细胞明显肿胀，肌纤维间隙变宽，排布紊乱，伴有炎细胞浸润，病理损伤评分明显升高（＜0.001）。与B组相比，C 组和D 组小鼠心肌病理损伤评分均明显降低（＜0.001），心肌细胞肿胀程度减轻，肌纤维间隙缩小，炎细胞浸润减少。

2.5 Ts-MES对小鼠血清中心肌损伤标志物的影响

ELISA检测结果显示（图5），和A组相比，B组小鼠血清中NTPro-BNP和cTnI水平明显升高（＜0.01），和B组相比，C、D两组小鼠血清中NTPro-BNP和cTnI水平均明显下降（＜0.05）。

2.6 Ts-MES对脓毒症心肌损伤小鼠血清中细胞因子水平的影响

ELISA 法测定各组小鼠血清中促炎细胞因子（TNF-α、IL-6）和调节性细胞因子（IL-10、TGF-β）的表达情况（图6），B组小鼠血清中TNF-α和IL-6水平较A组明显升高（＜0.001），C、D两组小鼠血清中TNF-α和IL-6水平较B组明显下降（＜0.05）。同时，C组小鼠血清中IL-10和TGF-β水平较B组明显升高（＜0.05），而D组小鼠血清IL-10和TGF-β水平较B组虽有升高趋势，但无统计学差异。

2.7 Ts-MES对脓毒症心肌损伤小鼠心肌组织中细胞因子水平的影响

B组小鼠心肌组织中TNF-α和IL-6表达量较A组显著升高（＜0.001），C、D两组小鼠心肌组织中TNF-α和IL-6表达量较B组均显著降低（＜0.01），同时，C组小鼠心肌组织中IL-10和TGF-β表达量较B组显著升高（＜0.01），而D组小鼠心肌组织中IL-10和TGF-β表达量较B组虽有增加趋势，但无统计学差异（图7）。

3 讨论

本实验在前期研究基础上，采用CLP法诱导脓毒症模型，并在脓毒症模型基础上，借助心脏超声、血清心肌损伤因子检测等方法筛选出稳定的心肌损伤小鼠，并以抗炎效果明确的临床脓毒症用药地塞米松作为阳性对照，观察旋毛虫肌幼虫排泄分泌蛋白Ts-MES对脓毒症心肌损伤小鼠的影响。实验结果表明，在CLP术后12 h，相比A组（假手术组），B组（模型组）小鼠心肌细胞明显肿胀、间隙变宽、排布紊乱并有炎症细胞浸润，超声心动图检测显示，小鼠左室收缩功能指标LVEF、LVFS和左室舒张功能指标E/A比均明显下降，且血清中心肌损伤因子NTPro-BNP和cTnI的表达明显升高，这说明CLP法诱导的脓毒症已对小鼠心肌构成显著伤害，疾病模型构建成功。

众所周知，炎性细胞因子在脓毒症疾病进程中发挥了重要作用，是引发器官功能损伤的根本原因，脓毒症初始阶段，以TNF-α和IL-6为代表的炎性介质大量合成，并启动炎症级联效应，刺激心血管内皮细胞产生过量的一氧化氮合酶iNOS，引发脓毒症心肌损伤，表现为心脏炎性细胞浸润，心肌细胞肥大肿胀，心脏收缩和舒张功能受损。在脓毒症环境下，心肌细胞自身也可释放TNF-α和IL-6，这进一步加剧了心肌损伤的严重程度。本实验发现，与A组对比，B组小鼠心肌细胞明显肿胀、间隙变宽、排布紊乱并有炎症细胞浸润，这与该组小鼠外周血清和心肌组织中TNF-α、IL-6表达量的显著增加关系密切。在分别给予Ts-MES和小剂量地塞米松治疗后，C、D两组小鼠血清和心肌组织中TNF-α、IL-6的表达量均显著下降，心肌病理损伤得到明显缓解，血清中NTPro-BNP、cTnI水平显著下降，LVEF、LVFS及E/A比显著回升，心脏收缩功能和舒张功能明显好转，小鼠术后72 h 生存率分别可达37.5%和50%，明显高于B组（0%）。以上结果表明，Ts-MES通过下调促炎细胞因子表达缓解了脓毒症心肌损伤，与小剂量地塞米松效果相似。从以往文献可知，旋毛虫排泄分泌物主要是通过激活宿主调节性Tregs参与免疫调控，活化的Tregs可增加IL⁃10和TGF⁃β等调节性因子的表达，从而发挥抗炎效应。本实验发现，和B组相比，Ts-MES治疗后的C组小鼠血清和心肌组织中IL-10、TGF-β表达量均显著升高，说明在炎症状态下，Ts-MES可能刺激Tregs活化并诱导了IL⁃10、TGF⁃β等调节性细胞因子表达。

综上所述，Ts-MES通过调节脓毒症心肌损伤小鼠的系统免疫和心脏局部免疫，抑制促炎细胞因子TNF-α和IL-6的表达，并促进调节性细胞因子IL⁃10和TGF⁃β的表达，从而发挥抑制性免疫调节功能，缓解了脓毒症诱发的心肌损伤，这与旋毛虫排泄分泌蛋白对脓毒症性肝、肾及肺脏损伤的保护机制具有一致性。