IRE1α缺陷通过上调内质网钙稳态蛋白降低软骨细胞的自噬功能

软骨细胞直接参与软骨生长、发育及软骨组织正常功能的维持。当软骨遭受机械、损伤、衰老、营养物质缺乏时，会引发细胞产生一系列响应性保护反应，其中内质网应激在维持细胞稳态方面发挥着重要作用。自噬作为真核细胞内另一种保护机制，通过溶酶体介导的蛋白质降解途径，吞噬和清除受损的细胞器、错误折叠蛋白质及其他大分子物质等，帮助细胞执行正常功能。研究表明，内质网应激和细胞自噬互为因果、互相影响、协同完成细胞正常功能的执行和稳态的维持，但二者之间具体的调控机制还不清楚。本研究旨在阐明软骨细胞中内质网应激关键调控分子肌醇依赖性激酶1α（IRE1α）如何通过内质网钙稳态蛋白（CHERP）和钙离子信号影响自噬，为进一步探究内质网应激与自噬的相互调控机制奠定基础，为软骨发育的机制探究提供新的思路，也可能为骨软化症、软骨发育不全等疾病的防治寻找到重要突破口和靶分子。

惠州市根除Hp处方大数据分析可见，单独考虑“三联疗法”或“四联疗法”标准，“三联疗法”、“四联疗法”根除Hp处方的使用率在2010年较低，2016年，基本“三联”处方率达到35.88%，“四联”处方率达到15.53%，说明惠州市的根除Hp处方正在逐步的规范化。见表3、图4。

1 材料和方法

1.1 材料

人软骨细胞C28/I2 由美国纽约大学Professor Chuanju Liu惠赠。DMEM、DMEM/F12培养基（BI）；抗体：IRE1α（CST）、GAPDH，XBP1（u+s）、Nrf2、PERK、p-PERK、β-actin、p-IRE1、LC3I/Ⅱ（CST，Proteintech）；抑制剂和激动剂：4μ8c、雷帕霉素（Rapa）、巴佛洛霉素A1（Bafilomycin A1）、衣霉素（TM）（MCE）、SYBR qPCR mix（Vazyme）、自噬双荧光病毒（汉恒生物）、PVDF膜（Millipore）、Ⅱ型胶原酶（Worthington）、小鼠基因组提取试剂盒（Bimake）、RNA提取试剂盒（Bioteke）ambion、八连管（Thermo scientific）、钙离子荧光探针（Beyotime）、Ripa裂解液（强）（Beyotime）、HiScriptII Q RT SuperMix逆转录（Vazyme）。

1.2 方法

1.2.1 原代细胞提取 课题组前期成功构建软骨组织特异性ERN1基因敲除小鼠（ERN1 CKO）。ERN1小鼠和ERN1；Col2-Cre小鼠交配繁殖所得同窝新生鼠经鼠尾基因型鉴定后，用2%的戊巴比妥钠加高浓度的CO处死，分离提取原代软骨细胞，并将细胞分为对照组（ERN1）和ERN1 CKO（ERN1；Col2-Cre）组。原代软骨细胞提取步骤：小鼠浸泡于75%酒精5 min后切开腿部表皮，暴露出完整腿部结构，向外侧挑开髌韧带，显微镊分离小鼠膝关节软骨（白色半透明状），除净表面韧带及肌肉。关节软骨经PBS冲洗干净后，Ⅱ型胶原酶（1 mg/mL）消化过夜，离心垂悬至培养皿培养。实验获得重庆医科大学动物伦理审委会的批准，并严格按照其要求进行实验操作。

1.2.2 质粒构建 NCBI 查询CHERP 的CDS 序列，Gene ID：10523，数据库显示共2751个碱基，设计PCR引物，扩增获得CHERP片段，运用LIC法连接重组质粒，DH5α感受态内扩增后送擎科生物公司测序，成功获得两株测序正确的单克隆菌落，真核表达质粒pcDNA3.1-（-）-CHERP构建成功（引物：方向为5'-3'，F：CTCGAGATGGAGATGCCGCTGCC；R：GATATCCTACTTACACTCGTCCC TGGCC，引物设计软件为Primer5，下划线部分为酶切位点，斜体为同源臂序列）。

分离ERN1基因缺陷的原代软骨细胞并进行敲除效率的验证，ERN1 CKO组IRE1α蛋白质表达水平（图3A）和mRNA表达（图3B）均明显下调，自噬相关蛋白ATG5、ATG7的表达明显下降（图3B）。在原代小鼠软骨细胞中加入自噬抑制剂Bafilomycin A1抑制自噬溶酶体生成后，Western blot结果显示，Bafilomycin A1（图3C-E）处理后Control+Bafilomycin A1组较Control组LC3 Ⅱ/LC3 I比值上调（＜0.01），ERN1 CKO +Bafilomycin A1组较ERN1 CKO组LC3Ⅱ/LC3I比值上调（＜0.05）、较Control+Bafilomycin A1组LC3Ⅱ/LC3I比值下降（＜0.05）。

幼儿教育是一生学习的启蒙阶段，对以后的学习有着重要的影响，而语言学习更是学习的基础，只有语言学习的更好，才能更好地开始其它学科的学习。因此这对教师语言教学能力有着严格的要求，教师语言教学能力的高低直接影响了幼儿的语言学习能力。教师的语言教学能力不仅体现了教师的个人素养，也对幼儿养成正确的言语有着重要的影响。因此，教师可以针对语言教学能力进行相关的训练，例如对教师组织培训活动、教师之间观察交流活动。教师在日常上课时，也可有意识地进行相关的训练。经过长时间的积累，教师就会掌握系统的语言教学方法，提高语言教学能力。

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1.2.6 4μ8c、Rapa、Bafilomycin A1实验 Rapa实验：细胞贴壁生长后，4μ8c（100 nmol/L）处理C28I2细胞24 h后，加入Rapa（25 μmol/L）处理6 h后提取总蛋白。Bafilomycin实验：Bafilomycin（500 nmol/L）处理原代软骨细胞24 h后提取总蛋白。

自噬双荧光病毒预处理原代小鼠软骨细胞24 h，加入自噬激活剂Rapa处理6 h后，自噬双荧光病毒实验显示ERN1 CKO鼠软骨细胞中LC3-GFP较Control组荧光增强（图4 A、B），加入内质网应激诱导剂TM处理12 h后（图4 C、D），出现相似结果。

1.2.8 免疫细胞荧光 细胞贴壁生长后换成无血清培养基进行转染，Lipofectamin2000（2 μL/μg）与质粒分别在37 ℃孵育5 min，混匀孵育10 min后加入培养基，6 h后换液，48 h后4%多聚甲醛固定细胞，依次进行0.5%Triton X-100通透10 min，PBS清洗，山羊血清封闭30 min，一抗4 ℃过夜（LC3，1∶200，LAMP1，1∶800），PBS清洗，荧光二抗室温避光孵育3 h，PBS清洗，DAPI避光孵育5 min，抗荧光衰减封片剂封片后，共聚焦显微镜下拍摄结果。

1.2.4 Western blot检测相关蛋白表达 待原代细胞长满约85%密度时，PBS清洗后加入Ripa裂解液，冰上裂解40 min，每10 min剧烈涡旋震荡1次，15 000 r/min离心12 min后吸取上清，加入6×SDS混匀后沸水浴8 min，所得蛋白按照实验室先前方法进行Western blot实验。

1.3 统计分析

明器，是一种专为随葬而仿照实物制成的器物〔1〕。雄安新区所在的河北省雄县、安新县、容城县，近几十年来在一些汉墓的发掘过程中土了许多模型明器，其类型较为丰富，具有一定的研究价值，是研究雄安新区汉代丧葬制度及思想文化等方面的重要资料。

整理国故，虽然首先是回到产生、盛行那个思想的具体时代，但更重要的是要评判是非、重估价值。众所周知，进化论的风靡同时带来一种“进步”的信念，表现在时间观上，即主张古今有别，进而强调自古及今是一个推陈出新、日益增进和提升的过程，古不及今。这种不可逆的线性时间观不仅嘲笑“德配天地道冠古今”的不变论，也有别于传统的循环、轮回思想，更冲击了各种以古为尊世风日下的历史倒退论。

2 结果

2.1 软骨细胞中内质网应激激活，伴随自噬水平升高

在C28/I2细胞中加入内质网应激诱导剂TM处理不同时间后，检测到内质网应激信号通路相关蛋白IRE1α（由ERN1基因编码产生），XBP1s表达上调（＜0.05）。自噬标记蛋白分子p62 表达下调（＜0.05），LC3Ⅱ/LC3I 表达上调（＜0.05），自噬水平上升（图1）。

1.2.5 细胞内荧光标记钙离子实验 用TM（10µg/mL）处理3 h后，将ERN1 CKO 和对照小鼠的原代软骨细胞收集在200µL HBSS平衡盐溶液中。将钙离子荧光探针4 μmol/L Fluo-4AM与细胞悬液混合，并在37 ℃下孵育20 min。HBSS洗涤2次后，使用含有1%FBS的HBSS（200µL）重悬细胞。然后将细胞悬液在37 ℃下孵育40 min。用HBSS洗涤后，用流式细胞仪检测细胞中钙离子的水平。

2.2 软骨细胞中抑制IRE1α磷酸化，自噬激活受损

C28/I2细胞中加入IRE1α磷酸化（p-IRE1α）抑制剂4μ8c 预处理24 h 后加入自噬激活剂Rapa（图2），Western blot结果显示，Rapa处理后LC3Ⅱ/LC3I 表达上调（＜0.01），Rapa联合4μ8c处理组相较Rapa组，LC3Ⅱ/LC3I 比值降低（＜0.05）。

2.3 软骨细胞中IRE1α敲除，自噬小体生成受阻

1.2.3 qPCR检测原代软骨细胞中ERN1、ATG5、ATG7的表达 待原代细胞长满约85%密度时，PBS清洗后加入RL裂解液按说明书步骤进行RNA提取与逆转录，所得cDNA用于qPCR反应，全部流程按照实验室先前方法步骤。（引物方向均为5'-3'，ERN1，F：ACACCGA CCACCGTATCTCA，R：CTCAGGATAATGGTAGCC ATGTC；ATG5，F：TGTGCTTCGAGATGTGTGGTT，R：GTCAAATAGCTGACTCTTGGCAA；ATG7，F：GT TCGCCCCCTTTAATAGTGC，R：TGAACTCCAACG TCAAGCGG）。

2.4 软骨细胞中IRE1α敲除，自噬溶酶体形成受阻

1.2.7 自噬双荧光病毒实验 用自噬双荧光腺病毒（GFP-LC3）预混polybrene（10 μg/mL）转染试剂转染原代软骨细胞细胞6 h后换液，24 h后用TM（0.5 μg/mL）或Rapa（25 μmol/L）处理细胞，观察不同时间点红绿荧光强度。在自噬流过程中，绿色荧光的强度逐渐减弱。

由于直齿轮的轮齿在接触的瞬间是整个齿宽的线接触，传动时产生的啮合冲击较大。斜齿轮也是线接触，但它是由齿面上一点开始，渐渐向下延伸而通过整个齿面，因而冲击较小，在载荷状态和转速相同的情况下，直齿轮的传动噪声比斜齿轮大5dB左右，但斜齿轮传动时有附加轴向力，故需采取平衡轴向力的措施。一般斜齿轮分度圆上的螺旋角β取16°～20°为宜。而人字齿类似于两个斜齿轮的组合，其在传动时无附加轴向力，传动平稳，噪声低。但制造相对复杂、成本比较高。

数据处理软件为GraphPad Prism 8。指标表示为均数±标准差，在方差齐性基础上应用单样本、两独立样本检验以及单因素方差分析进行组间比较，＜0.05时，差异有统计学意义。所有实验独立重复3次。

2.5 软骨细胞中IRE1α调控CHERP表达及钙离子浓度

Western blot结果显示，ERN1 CKO鼠软骨细胞中CHERP表达较Control组上升（＜0.05，图5）。钙离子荧光探针结果显示，IRE1α缺陷型软骨细胞胞内钙离子含量明显上升（＜0.01，图6A、B）。

2.6 软骨细胞中过表达CHERP抑制自噬激活

为进一步研究CHERP 与自噬的关系，构建pcDNA3.1-（-）-CHERP真核表达质粒，酶切结果显示重组质粒连接成功（图7A），质粒测序（图7B）后进一步在C28/I2细胞内验证过表达效率，Western blot结果显示两株单克隆菌落来源的CHERP真核表达质粒构建成功（图7C）。C28/I2细胞中转染真核表达质粒pcDNA3.1-（-）-CHERP 48 h后，p62蛋白表达水平上调（图8A）。

2.7 软骨细胞中IRE1α挽救CHERP抑制的自噬

为进一步探究IRE1α，CHERP以及自噬之间的关系，在C28/I2细胞中转染真核表达质粒pcDNA3.1-（-）-IRE1α与pcDNA3.1-（-）-CHERP 48 h后，自噬小体LC3免疫荧光检测（图9）显示，pcDNA-3.1-（-）-IRE1α组较pcDNA-3.1-（-）对照组LC3荧光增强，pcDNA3.1-（-）-CHERP 处理组较对照组LC3荧光减弱，pcDNA3.1-（-）-IRE1α+pcDNA3.1-（-）-CHERP处理组LC3荧光强度介于两单独处理之间。

3 讨论

IRE1α作为内质网应激感受器，通过感知内质网应激时的压力刺激，向下游传递信号，激活未折叠蛋白反应，参与应对内质网应激带来的压力，实现对细胞的保护。研究表明IRE1α/XBP1s信号通路参与维持软骨细胞稳态减少凋亡，但IRE1α调控软骨细胞生理活动的具体机制还有待进一步研究。自噬作为细胞基本生理功能之一，有研究报道自噬在软骨的发育生长过程中有着不可或缺的作用，完整的自噬流包括自噬小体的形成，自噬小体与溶酶体融合，以及溶酶体内的降解。研究证实自噬与内质网应激二者是动态互连的，内质网应激激活后，对于自噬具有诱导和抑制的双重作用，通过调控自噬实现对细胞增殖、分化和凋亡的动态调节，而目前关于软骨细胞中IRE1α与自噬相互关系还有待进一步研究。本文我们重点探讨了软骨细胞中IRE1α调控自噬的作用与机制。

首先我们在人软骨细胞C28/I2中观察到内质网应激激活剂TM上调自噬水平，与相关文献报道一致。实验结果显示，自噬诱导剂Rapa处理后，IRE1α磷酸化抑制剂4μ8c抑制C28/I2细胞中p-IRE1α水平，同时LC3Ⅱ/LC3I的比值下调，提示C28/I2细胞中IRE1α功能活性受损可以部分抑制自噬的激活（图2）。然后通过提取ERN1 CKO小鼠原代软骨细胞验证发现，敲除IRE1α后，自噬相关蛋白ATG5和ATG7的表达降低，提示自噬可能受损（图3B）。自噬抑制剂BafilomycinA1通过抑制自噬溶酶体的生成，阻断LC3Ⅱ的降解，从而导致LC3Ⅱ蓄积性增高，我们使用BafilomycinA1处理原代软骨细胞后观察到IRE1α敲除后，下调原代软骨细胞中LC3Ⅱ的蓄积性增高，提示IRE1α缺陷时，软骨细胞中自噬小体生成受阻（图3C）。进一步在原代软骨细胞中通过自噬双荧光病毒实验验证自噬流的变化，观察到Rapa或TM处理后，未降解的LC3-GFP荧光强度明显高于对照组，提示自噬小体的降解受阻，即自噬溶酶体生成受到抑制（图4）。此外，研究指出细胞内钙离子在调节细胞自噬以及细胞凋亡中起关键作用，其中有研究表明钙离子对自噬起负向调控作用，也有研究表明钙离子对自噬发挥双重调节的作用。我们进一步探究IRE1α对钙离子的调节作用，发现IRE1α缺陷的软骨细胞中内质网钙稳态蛋白CHERP以及钙离子含量明显上升（图5、6）。在C28/I2细胞中过表达CHERP，抑制自噬激活（图7、8），过表达IRE1α能部分恢复CHERP抑制的细胞自噬（图9）。结合前文实验，提示软骨细胞中IRE1α可能通过调节CHERP影响钙离子信号进而调控自噬的激活。后续我们将进一步验证，IRE1α如何通过自噬影响软骨细胞的生理活动。综上，本文成功从ERN1CKO小鼠中分离出原代软骨细胞，后续实验结果显示软骨细胞中敲除IRE1α，内质网钙稳态蛋白CHERP表达上调，胞内钙离子含量上升，同时阻滞自噬流中自噬小体与自噬溶酶体的形成。本研究初步阐明软骨细胞中IRE1α调控自噬的可能机制，为进一步探究IRE1α与软骨发育，软骨相关疾病的关系提供一定的理论基础。