益气解毒方治疗原发性肝癌的作用机制：基于网络药理学及分子对接方法

原发性肝癌主要发病原因为乙型肝炎病毒慢性感 染，其发病初期多无明显症状，但病情发展迅速，预后较差，生存期较短。其在中医学中并无准确对应的病名，但是历代医家结合临床症状及体征将其归于“肝积”、“癥积”、“胁痛”、“黄疸”、“积聚”等中医范畴，且认为其发病根本原因为正气不足。原发性肝癌被发现时多已为中晚期，丧失手术机会，以中医治疗可缓解患者现有症状，延长生存期。本研究团队张国梁教授总结出益气解毒方用于治疗原发性肝癌：益气解毒方中包括生黄芪30 g、炒白术20 g、白花蛇舌草12 g、半枝莲12 g、川芎10 g、半边莲15 g、枸杞子15 g。黄芪、白术益气固表止汗利水，研究表明其可有效提高机体免疫力，可抗肿瘤、抗病毒等。据目前报道，可从白术中分离的化学成分有80余种，这些成分主要起到抗炎、抗肿瘤等作用。白花蛇舌草、半枝莲、半边莲清热解毒、散结止痛消肿，白花蛇舌草主要成分为白花蛇舌草多糖，其是抗炎、抗肿瘤、提高免疫力等活性的有效免疫调节剂，而白花蛇舌草与半枝莲中的总多糖、半边莲的提取物对众多癌病均有着治疗作用。川芎行气活血止痛，枸杞子补益肝肾、调和诸药，川芎与枸杞子其对机体多个系统有着药理活性，主要作用为抗肿瘤、细胞保护、抗炎等。

目前对于以上七味中药的单个研究较多，但尚无对于将七味药综合而用的研究，而本研究团队的张国梁教授将七味药合用，在临床可达益气化瘀、散结止痛利水之功。现尚未有明确研究报道说明益气解毒方治疗原发性肝癌的作用机制。因此，本研究基于网络药理学及分子对接，研究益气解毒方治疗原发性肝癌的作用机制，并构建体外实验，进一步验证其作用机制。

1 材料和方法

1.1 信息收集

在中药系统药理学分析平台（TCMSP）、Uniport数据库（https://www.uniprot.org/）、人类基因数据库（Genecards）筛选出益气解毒方主要药物成分及靶点、靶点对应的基因名以及原发性肝癌疾病的相关靶点基因。根据口服利用度（OB）＞30%、类药性（DL）＞0.18条件筛选有效成分。将益气解毒方主要有效成分及基因，导入Cytoscape3.8.2软件，得出“药物-成分-基因”网络图。

1.2 核心基因提取

将疾病相关靶点、药物对应的共有基因导入Venny 2.1在线工具，绘制韦恩图，得到共同靶点基因。将其名称输入String数据库（https:/ string-db.org/cgi/input.pl），研究物种为“Homo sapiens”，获得蛋白与蛋白之间互作关系。导入Cytoscape3.8.2软件，采用2倍中位数法提取核心基因，再通过计算核心基因网络中各个属性值，提取出最终核心基因。

1.3 GO和KEGG通路富集分析

采用David 数据库（https：//david.ncifcrf.gov/），限定物种为“HomoSapiens”，提交后在GO Molecular Functions、GO Biological Processes、GO Cellular Components、KEGG Pathway导出结果。对药物-疾病基因进行GO功能分析以研究益气解毒方治疗原发性肝癌的主要生物过程；进行KEGG通路富集分析以研究药物治疗疾病的相关信号通路。再使用“微生信”，将GO、KEGG分析结果输入，得出气泡图、条形图进行分析。

从意境来看，就不得不提及一个时空的问题。中国绘画艺术通过视觉的转换变化，赋予空间以时间性的运动特征，还透过独特的透视方法“三远法”达到画面层次的丰富，从而使得其在内部成为了时空结合体。使得绘画空间在流动中变换，此时谓之有意境。

实时荧光定量PCR实验：收集HepG2细胞沉淀，加入1 mL TRIzol裂解，裂解完全后加入0.2 mL氯仿经剧烈震荡、离心后取上清（约500 µL）加入到另一EP 管中。再加入0.5 mL预冷的异丙醇，-20 ℃孵育30 min后离心，弃去上清，加入1 mL预冷的75%乙醇离心5 min，弃上清，重复后可得室温干燥RNA沉淀，加入20～50 μL DEPC水，-80 ℃保存备用。取RNA 1 μg行RT反应得出为cDNA，-80 ℃保存。取出cDNA 作为荧光定量的模板，反应体系10 µL，包括2×SYBR Green mixture 5 µL、Forward primer（10 µmol/L）1 µL、Reverse primer（10 µmol/L）1 µL、cDNA 1 µL、RNase Free water 2 µL；反应条件为95 ℃预变性1 min，95 ℃PCR反应20 s，60 ℃延伸1 min，共循环40次，最终得出扩增曲线、溶解曲线以及相对表达量。本次实验所采用Relative Quantification Study，计算方法为2。实验所需指标引物序列如表2。

1.4 分子对接

将最终核心基因、益气解毒方有效成分分别导入RCSB数据库（http：//www.rcsb.org/）、Pubcham数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），下载对应的3D结构。再将3D结构导入AutoduckTools予以加氢、去电荷等处理后计算二者结合力。

1.5 实验验证

将各个药物对应靶点输入Uniport数据库中，选择“UniProtKB，Reviewed，Human”筛选出药物靶点对应基因名，通过去除无效靶点，最终得出七味中药对应基因各有450、22、249、574、42、439、356个。

1.5.2 验证实验 细胞活力检测：分为LO-2（正常人肝细胞株）和HepG2（人肝癌细胞株）2组细胞。胰酶消化上述2组对数期细胞，将其处理后，接种于细胞培养板中，放入培养箱中培养，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）；5%CO，37 ℃孵育过夜，倒置显微镜下观察。将HepG2分为4组，每组分别加空白血清、5%、10%、20%含药血清，再将每组都分别培养24、48、72 h后，加入10µL/孔CCK8，继续培养4 h。酶联免疫检测仪测量各孔的吸光值。同时设置空白孔。细胞活力=［（实验孔-空白孔）/（对照孔-空白孔）］×100%。

此时，曾先生也失去了理智，他把背包扔到地上，然后向前扑倒在地上号叫。曾先生表示，当时没有考虑这种方式是否妥当，只是想控诉警方的作为，并向路人求助。

将“primary carcinoma of the liver”输入Genecards数据库中，得出原发性肝癌相关靶点基因共1598个。将其与益气解毒方中药物对应的共有基因导入Venny 2.1 在线工具，绘制韦恩图，得到共同蛋白基因共101个（图2）。

GO分析结果显示，涉及益气解毒方治疗原发性肝癌的生物过程共605个，主要的生物过程是：BP-ephrin receptor signaling pathway，movement of cell or subcellular component；CC-blood microparticle，focal adhesion；MF-iron ion binding等；分别按照FDR降序排列，选择前10位进行条形图展示分析（图4）。KEGG分析结果显示，涉及益气解毒方治疗原发性肝癌的相关信号通路共89个，其中主要相关信号通路包括：Platelet activation、Tyrosine metabolism、AMPK信号通路、RIGI-l样受体信号通路、Wnt信号通路、趋化因子信号通路、Ras 信号通路、ErbB 信号通路、Salmonella infection等。按照FDR降序排列，选择前20位进行气泡图展示分析（图5）。

在20世纪70年代，美国学者T.L.Saaty提出了层次分析法，一经推出就引起了世界系统工程人员的兴趣。层次分析法把与决策始终相关的元素进行分解，分为方案、准则、目标等层次，同时进行定量定性分析。根据定量和程度等级方法的结果，可以从很大程度上出现定性分析的可能性。这种方法符合人们的主观判断思维，有利于从客观的角度去整理和思索。由于层次分析的方法具有实用性、科学性和系统性，运用这种方法能够在很多领域解决实际问题，例如在煤矿运营领域。

反思：凡是遇到关于铁的题时,首先想到的就是铁的价态。多种物质之间同时进行的反应,究竟是谁先反应,是考生往往容易犯的错误,也是命题者常设的陷阱。一般的规律是:一种氧化剂与多种还原剂反应,或一种还原剂与多种氧化剂反应,强的氧化剂和强的还原剂优先反应,也称“强强反应”或“强强联合”。

1.6 统计学方法

将共同蛋白基因名称输入String 数据库，选择Multipleproteins，研究物种为Homo sapiens，获得蛋白与蛋白之间互作关系。将结果导入Cytoscape3.8.2软件，将数据进行Analyze Nexbook计算出degree值，再采用2倍中位数法卡出degree值2倍中位数对应的数据，再通过计算核心基因网络中各个属性值的中位数，卡出最终核心基因（图3）。最终核心基因为：DDX5，HNRNPK，PABPC1，DHX9，RPS3A，RPS3，RPL13，NCL。

2 结果

2.1 益气解毒方中主要药物的有效成分及靶点

筛选出黄芪、白术、白花蛇舌草、半枝莲、川芎、半边莲、枸杞子七味中药各有19、4、5、23、6、16、37个有效成分。根据各个药物的有效成分通过TCMSP中related targets 得出七味中药各有靶点465、23、256、584、42、409、359个，共2138个。

1.5.1 主要材料 药物-益气解毒方（生黄芪30 g、炒白术20 g、白花蛇舌草12 g、半枝莲12 g、川芎10 g、半边莲15 g、枸杞子15 g）（安徽省中医院中药房）；细胞株-LO-2（正常人肝细胞株）、HepG2（人肝癌细胞株）、空白血清、5%含药血清、10%含药血清、20%含药血清（安徽中抗生物技术有限公司）；CCK8检测试剂盒、HNRNPK（相对分子质量51 000）、PABPC1（相对分子质量70 000）（BIOSS），胰酶（碧云天），β-Actin（相对分子质量42 000，Zsbio），Nucleolin（相对分子质量76 000，abcam），DHX9（相对分子质量141 000，abclonal），RIPA细胞裂解液（强）、Western一抗二抗去除液（Beyotime），SDS、PAGE 胶促凝剂（Solarbio），PVDF 膜（Millipore），ECL超敏发光试剂盒（Thermo），Trizol（Life technogies），氯仿（上海苏懿化学试剂有限公司），无水乙醇、异丙醇（上海广诺化学科技有限公司），Novostart SYBR qPCR SuperMix Plus(荧光染料)（novoprotein），PrimeScript™RT reagent Kit with gDNA Eraser（反转录试剂盒）（TaKaRa）；常温微量离心机（海门市其林贝尔仪器制造有限公司），高速冷冻离心机（安徽嘉文仪器装备有限公司），荧光定量PCR仪、PIKO Plate Illuminator（Thermo Scientific）。

将药物、靶点、基因整理导入Cytoscape软件中，得出“药物-靶点-基因网络”图（图1）和共有靶点（表3）。

2.2 疾病靶点基因

Western blot实验：LO-2、HepG2细胞接种于6孔板中，HepG2细胞分4组，每组分别加入空白血清、5%、10%、20%含药血清培育48 h后，加入RIPA细胞裂解液600 µL进行裂解、提取组织总蛋白；根据TRAKRA产品目录进行SDS-PAGE凝胶配置，浓缩胶（2 mL）10%分离胶（10 mL）。在收集的蛋白样品中按照1∶4加入5X SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。将滤纸和PVDF膜，浸入转膜缓冲液中5 min，通过转膜装置进行恒流转膜；转膜完毕后，蛋白膜放置到Western洗涤液中漂洗5 min，加入Western封闭液（5%脱脂奶粉）封闭2 h。后按照合适的比例（表1）在4 ℃用一抗稀释液进行稀释过夜，辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶2000稀释）反应1.2 h。参考相关说明书，使用ECL发光试剂盒来检测蛋白。

2.3 核心基因筛选

采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差表示，对符合正态分布的数据，组间比较采用独立样本检验，对于不符合正态分布的数据，组间比较采用秩和检验。＜0.05为差异具有统计学意义。

我们可以感受到一种力量的美，它刚劲而又柔美。陶瓷工匠们需要在窑炉前等待很久。然后，在某个黎明时分，带着预期中的悲喜交集，当窑炉的门再次开启，土坯们已然露出幽微的冷光，它们像一条条蜕皮的蛇，安静地躺在窑里。轻烟翻滚，从窑洞里源源涌出，直上天穹。烧瓷人忍不住跪倒在地，顶礼膜拜……

2.4 GO、KEGG分析

如果烧烫伤达二度以上，就会在痊愈后留下疤痕。为了减轻疤痕给宝宝带来的痒和不适感，也为了减轻疤痕的生长程度，在伤口痊愈后一周左右，可以开始做疤痕按摩。建议您按摩前应先清洗皮肤且涂上润肤露，然后用手掌肥厚部位或大拇指指腹轻压在皮肤上，在原处作旋转式的按摩或按压，不可以用推揉的方式摩擦伤口，以免表皮无法承受而受损。

2.5 分子对接结果

通过RCSB PDB 数据库得出HNRNPK、PABPC1、DHX9、NCL 分别对应的ID 为1ZZK、3KUJ、3VYX、2FC8，下载3D结构；通过Pubcham数据库得出益气解毒方有效成分的3D结构，两者进行分子对接（图6）。结果显示大多数均可以在自然条件下进行对接，其中53对对接结果良好（表4）；PABPC1与Stigmasterol结合能最高，为-7.46 kcal/mol。

2.6 验证实验结果

细胞活力检测实验显示，当含药血清浓度逐渐增大时，细胞活力逐渐受到抑制（＜0.01），含药血清浓度大于10%后细胞活力抑制水平基本稳定；其中细胞培养48、72 h，细胞活力受抑制作用基本一致（图7，＞0.05）。蛋白检测的结果显示，随着含药血清浓度逐渐增大，HepG2中蛋白的相对表达量逐渐降低（＜0.05）（图8）。实时荧光定量PCR实验结果显示，加入含药血清后HepG2中蛋白的mRNA相对表达量逐渐增高（＜0.05），但10%与20%的表达量基本相同（图9），即10%含药血清为最适宜量。

3 讨论

本研究通过对益气解毒方与原发性肝癌进行核心靶点筛选、主要通路研究、结合能计算等了解到益气解毒方与原发性肝癌密切相关，对于治疗原发性肝癌有着重要作用。本研究通过网络药理学得出药物-疾病核心靶点共8 个，分别为DDX5、HNRNPK、PABPC1、DHX9、RPS3A、RPS3、RPL13、NCL。已有研究表明敲低DDX5可抑制肝癌细胞的迁移、侵袭和上皮间质转化过程；生物信息学分析显示在肝癌中，PABPC1为真正枢纽基因，多因素分析显示肝癌的独立预后因素为PABPC1，PABPC1mRNA在肝癌组织中的表达亦处于最高位。在人癌细胞中DHX9发挥着抗病毒活性的作用，可靶向于提高溶瘤痘病毒对癌细胞的活性的限制。RPS3A的降解可能抑制核糖体翻译功能的启动，从而使某些参与细胞生命活动的重要蛋白质无法合成，影响肿瘤细胞的正常代谢，导致细胞凋亡。RPS3在细胞凋亡和DNA修复等核糖体外功能和翻译中发挥着多种作用；多种细胞功能表明HNRNPK参与肿瘤发生，具有抑制肿瘤形成的作用；肝癌中NCL的表达水平与肿瘤分化程度和患者生存期息息相关。RPL13能通过促进核因子κB和IFN-β基因启动子的诱导和激活，增强抗病毒因子IFN-β和促炎细胞因子白介素-6的表达和蛋白分泌。而本研究分子对接结果则显示药物有效成分能够与核心基因中DHX9、HNRNPK、NCL、PABPC1存在良好的结合能力，表明益气解毒方可能是通过核心基因对原发性肝癌产生治疗作用。

对于益气解毒方治疗原发性肝癌主要生物过程及相关信号通路而言，有研究对于子宫内膜样肿瘤的全基因组基因表达进行microRNA-mRNA靶向分析，结果显示大量靶向基因参与ephrin receptor signaling pathway。微粒是主要由各种类型的细胞在血液中脱落的磷脂囊泡，这些微粒包含其亲代细胞蛋白质组的一个子集，它们在生物体液中存在现成可用性，因此其可能为细胞损伤的标志物。自噬介导的粘着斑降解的阻断或逆转可使肿瘤转移抑制增强。大多数中医血瘀证患者存在血小板活化现象，而活血化瘀类中药主要通过抑制血小板上CD62p的表达来抑制血小板活化。据报道，酪氨酸在肝脏中得以降解，主要是通过一系列酶促反应完成的；酪氨酸分解代谢酶酪氨酸氨基转移酶在原发性肝癌患者中表达异常。AMPK在肝脏中参与脂质代谢调节主要通过磷酸化来完成，其活化能够减轻肝损伤和炎症。RIG-I样受体通过识别病毒及多种信号通路和调控机制来控制病毒感染反应。Wnt信号通路参与胚胎发育和致癌过程中的生理病理过程，目前已经发现在多种肿瘤中存在Wnt信号传导途径的异常激活，可通过阻断Wnt信号转导途径以达到治疗肝癌的目的。趋化因子信号是肿瘤微环境中的一部分,其在肿瘤进展中起着关键作用。RAS两大功能轴对于机体平衡及疾病发生发展起着关键性作用，具体表现在经典轴通过介导多种信号传导级联参与多种疾病的病理过程，非经典轴通过反馈调节机制来逆转经典轴介导的损伤。若ErbB发生突变，则会导致多种癌发生，其包括四个酪氨酸激酶受体，当受体与其对应配体结合后，激活相关基因，调控细胞的增殖、分化、迁徙和凋亡等过程。由此可看出益气解毒方可通过多条通路影响原发性肝癌的表达，减轻肝脏损伤。本研究体外实验进一步认证了益气解毒方能够影响原发性肝癌蛋白的表达，进而达到治疗肝癌的目的。

本研究通过网络药理学、分子对接对益气解毒方进行了深入解读，说明了益气解毒方与原发性肝癌之间密不可分，而体外实验进一步证明了益气解毒方能够对原发性肝癌肝癌起到治疗作用。本研究为原发性肝癌的治疗提供新思路、新途径，也为中医能够治疗原发性肝癌提供科学依据。