补骨脂乙素通过多途径诱导人乳腺癌MCF-7细胞死亡

乳腺癌在女性恶性肿瘤中发生率位于第1位，其病 死率在癌症相关死亡中位于第2位，严重危害着女性的健康和生命。目前，虽然乳腺癌的临床治疗取得了一定的效果，但还存在一些不足和难题，如手术的创伤、化疗的不良反应以及靶向药物昂贵的治疗费用等。因此，寻找和研制一种安全、有效及经济的乳腺癌治疗药物是医药工作者的使命。

天然产物具有结构新颖、多靶点及低毒性的优势，已逐渐成为抗肿瘤新药研发的重要来源之一。补骨脂乙素（IBC）是从中药补骨脂（Psoralea corylifolia L.）中提取分离的查尔酮类黄酮，结构中含有3个酚羟基，并且A环上有1个异戊烯基取代（图1A）。黄酮类化合物添加官能团异戊烯基，可增加脂溶性和对生物膜的亲和力以及靶蛋白的相互作用，从而可以显著提高化合物的生物活性。IBC作为中药补骨脂中主要活性成分之一，具有多种机制的抗肿瘤作用，如抑制Akt信号通路而抑制多种肿瘤细胞的增殖，诱导急性髓系白血病HL-60细胞活性氧（ROS）依赖的线粒体凋亡和分化，调控ERK/RSK2 信号通路而诱导肝癌HepG2 和HepG3B细胞凋亡，下调ER乳腺癌细胞中CD44的表达而提高对E2诱导的紫杉醇耐药敏感性等。然而，目前有关IBC对人乳腺癌MCF-7细胞死亡的作用及机制尚不明确。因此，本研究将以MCF-7细胞为研究对象，探索和研究IBC对细胞增殖、凋亡、自噬的影响，阐明其作用机制，为抗乳腺癌药物的研制提供研究基础。

1 材料和方法

1.1 细胞株及细胞培养

人乳腺癌MCF-7细胞（中科院上海细胞库）培养于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中，在5%CO，37 ℃以及饱和湿度的无菌培养箱中传代培养，取处于对数生长期的细胞进行后续实验。

按照国务院对地理国情监测工作总体部署和测绘地理信息事业转型发展需要，从2016年起地理国情信息获取进入常态化监测阶段。本文通过对在地理国情监测生产中频发性、关键性问题的分析，总结归纳了基础性地理国情监测成果质量控制的方法。

1.2 主要试剂

DMEM高糖培养基、胰酶、胎牛血清（Gibco）；二甲基亚砜（DMSO）、四甲基偶氮唑蓝（MTT）、Nec-1、z-VAD-fmk、氯喹（Sigma）；recilisib（MCE）；100×双抗（青霉素/链霉素）、结晶紫染液、Annexin V-FITC/PI双染试剂盒、ATP检测试剂盒、ROS检测试剂盒、JC-1线粒体膜电位检测试剂盒（杭州碧云天公司）；抗体Bax、Bcl-2、Akt、p-Akt（Ser473）、p62、LC3、β-actin（CST）；ECL发光液、PVDF（Millipore）；IBC由蚌埠医学院药物化学研究室提供，纯度为96.9%。

1.3 MTT比色法检测IBC对细胞增殖的影响

将处于对数成长期的MCF-7细胞经胰酶消化、离心、重悬后接种于96孔板中，每一孔内接种细胞数量为8000个，继续培养。待细胞贴壁后，处理不同浓度IBC（5、10、20、40、80 μmol/L），与工具药z-VAD-fmk、Nec-1或CQ合用时，先分别单独加入20 μmol/L的工具药预处理1 h后换培养液，再加入40 μmol/L的IBC。加药之后，将96孔板置于培养箱中继续分别培养24、48、72 h，同时设置阴性对照组和空白对照组。培养结束后，每孔加入5 μg/L的MTT溶液各10 μL，继续放置培养箱内孵育4 h，取出培养板，吸除各孔内的液体，每孔加入100 μL的DMSO溶液，置于37 ℃培养箱孵育30 min后，用多功能酶标仪（BioTek，上海艾研生物科技公司）检测吸光度值。计算细胞存活率（%）=（实验组值-调零组值）/（对照组A值−调零组值）×100%。上述实验重复3次。

1.4 Annexin V-FITC/PI染色结合流式细胞仪检测细胞凋亡

将MCF-7细胞按1.5×10个密度接种于12孔板过夜贴壁后，处理不同浓度的IBC（10、20、40、80 μmol/L）。继续培养3 h后，冰上收集细胞，置于1500 r/min离心10 min，吸除上清液。每管加入500 μL 稀释好的DCFH-DA（按1∶1000用无血清培养基稀释DCFH-DA，使其终浓度为10 μmol/L），置于37 ℃细胞培养箱孵育30 min。孵育结束后，再次离心，去除上清液后加入500 μL预冷的PBS，在流式细胞仪上检测细胞内ROS水平的变化。实验重复3次。

1.5 荧光染色结合荧光显微镜观察细胞死亡

将MCF-7细胞按1.5×10/孔的浓度接种于12孔板中，处理不同浓度的IBC（10、20、40 μmol/L）后继续培养24 h。用PBS清洗2次，每孔加入4%多聚甲醛1 mL，在室温条件下固定10 min。吸除固定液，并加入10 μL的DAPI染液，室温孵育10 min后，洗除DAPI染液降低背景干扰。向各孔加入Annexin V-FITC染色液5 μL、PI染色液5 μL，室温孵育15 min，在荧光显微镜（IX-71，Olympus）下观察荧光强度的变化。

将MCF-7细胞按2×10细胞/孔的密度接种于6孔板，待细胞贴壁后，处理不同浓度的IBC（10、20、40、80 μmol/L）。继续培养5 h后，每孔加入200 μL的裂解液，于冰上裂解10 min后，12 000 r/min离心5 min，取上清液用于后续测定。另取一块不透光96孔板于冰上，每孔加入100 μL的ATP检测工作液（按照ATP检测试剂盒说明书1∶9稀释，冰上配制）室温放置5 min后，向96孔板分别加入40 μL的样品，混匀，反应2 s后，用多功能酶标仪进行检测。实验重复3次。

1.6 免疫印迹法

将处于对数生长期的MCF-7细胞按5.0×10/孔的浓度接种于6孔板中，继续培养16 h至贴壁。更换含不同浓度的IBC（10、20、40、80 μmol/L）或等体积DMSO的新鲜培养液，继续培养24 h。经收集细胞、提取蛋白、采用BCA法进行蛋白定量、SDS-PAGE电泳，PVDF膜进行转膜，封闭后，按照抗体说明书比例用TBST稀释一抗（Bax、Bcl-2、Akt、p-Akt、p62、LC3及β-actin）4 ℃孵育过夜。一抗孵育结束后，用TBST清洗PVDF膜，并加入相对应的二抗，室温孵育2 h。二抗孵育结束后，再次用TBST清洗PVDF膜，ECL曝光显影，通过凝胶成像系统（Bio-Rad）进行分析。

来形成和积累了完整的中医药理论体系及临床使用经验。例如，天然产物雷公藤甲素、和厚朴酚等作为天然药物的活性成分，具有较好的抗癌活性，已成为具有较好的应用前景的抗癌新药。我们前期研究中，发现IBC 对人乳腺癌MCF-7 细胞具有一定的细胞毒性。IBC作为传统中药补骨脂的活性成分之一，对多种肿瘤细胞具有较强的杀伤作用，但对于乳腺癌MCF-7细胞的研究未见报道，具有较好的潜力值得挖掘。

1.7 透射电镜

电镜结果显示（图5A），IBC处理的MCF-7细胞胞浆内观察到了自噬泡以及自噬小体。随着IBC浓度的增加，自噬相关蛋白p62、LC3-II的表达逐渐升高，LC3-I的表达逐渐降低，从而使LC3-II/I的比值显著升高（图5B）。另外，自噬抑制剂CQ预处理1 h后，合用IBC（40 μmol/L）组的细胞生存率比单用相同浓度的IBC 组下降了23.3%（图5C）。

1.8 ATP检测

评估模块为整个系统的应用层，是核心技术。通过人工智能技术，完善评估模块，建立多种模型，耦合多个可能造成影响的因素，最终实现数据自动评估，主动上传，最后自动实现无人值守式的地灾预警。

利用数据挖掘技术分析HIF-1α在胃癌中的预后意义…………………………………孙美涛，自加吉，陈 莹，严长宝，戴莉萍，余 敏，熊 伟（32）

国外政界人士、学术界和媒体对“***新时代中国特色社会主义思想”进行了初步探究，研究成果对国内研究有借鉴价值。

1.9 活性氧（ROS）水平的检测

将处于对数成长期的MCF-7细胞按1.5×10/孔的浓度接种于12孔板中，待细胞贴壁后处理不同浓度的IBC（10、20、40 μmol/L）继续培养24 h。培养结束后，经PBS清洗、胰酶消化、离心，将每管中内细胞数控制在5×10。然后，每管分别加入缓冲液500 μL 和Annexin V-FITC染色液5 μL轻轻混匀15 min，再加入PI染色液5 μL，并在室温下避光孵育10 min后，使用流式细胞仪（BD）进行检测分析。

1.10 JC-1试剂盒检测线粒体膜电位

我们通过JC-1染色结合荧光显微镜检测了细胞内线粒体膜电位的变化情况。不同浓度的IBC作用于细胞后，利用荧光显微镜观察到红色荧光逐渐转变为绿色，提示细胞线粒体膜电位下降（图6A）。随着IBC给药浓度的增加，MCF-7细胞内ATP的水平逐渐下降，当IBC的浓度40 μmol/L和80 μmol/L时，细胞内ATP水平分别下降至55.37%和26.86%（图6B）。利用荧光探针DCFH-DA检测细胞内ROS水平时，发现与对照组相比，随着IBC作用浓度的增加，细胞内ROS水平显著升高（＜0.05，图6C）。

1.11 统计学分析

实验数据采用SPSS16.0、GraphPad Prism9.0统计软件进行分析，两组间比较采取独立样本检验，多组间比较采用方差分析，所有实验每组均独立重复3次以上，实验结果以均数±标准差表示，＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 IBC对MCF-7细胞的增殖的影响

为检测IBC对乳腺癌细胞增殖的影响，我们采用MTT比色法检测了不同浓度的IBC（0～80 μmol/L）作用于MCF-7细胞24、48、72 h后的细胞存活率。量-效曲线结果显示（图1B），随着IBC给药浓度的增加以及作用时间的延长，MCF-7细胞存活率逐渐降低，其作用24、48、72 h 的半数抑制浓度（IC）值分别为38.46±0.75、31.31±0.63、28.26±0.48 μmol/L。

2.2 IBC诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡的作用

Annexin V-FITC/PI双染结合流式细胞术结果显示（图2A），随着给药浓度的增加，IBC诱导MCF-7细胞发生死亡比列逐渐升高，其死亡率分别为7.1%、36.2%、56.1%。荧光双染实验结果显示（图2B），随着IBC浓度的增加，代表晚期凋亡（或坏死）的红色荧光和代表早期凋亡的绿色荧光的荧光强度均显著增强。预处理z-VAD-fmk（pan-caspase抑制剂）后合用IBC，与单独处理IBC 组（40 μmol/L）相比，合用组的细胞存活率为（63.88±6.41）%，明显高于单独处理IBC 组（36.85±3.52）%，z-VAD-fmk保护了IBC诱导的MCF-7细胞死亡（＜0.05，图2C）。与此相比，预处理程序性坏死抑制剂Nec-1时，合用组与单独处理IBC组之间的细胞存活率差异无统计学意义（＞0.05）。

2.3 IBC对凋亡相关蛋白表达的影响

免疫印迹实验结果显示（图3A），与对照组相比，随着IBC浓度的增加，MCF-7细胞内促凋亡蛋白Bax表达量逐渐升高，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达量降低，从而使Bax/Bcl-2的比值显著升高（图3B～C）。另外，IBC浓度依赖性地降低MCF-7 细胞内Akt 蛋白以及磷酸化p-Akt（Ser473）的表达。预处理recilisib（Akt激动剂）后合用IBC，与单独处理IBC组（40 μmol/L）相比，合用组的蛋白表达显著高于单独处理IBC组（图4A～C）。以上结果与对照组相比差异均具有统计学意义（＜0.05）。

2.4 IBC诱导MCF-7细胞自噬的作用

将生长状态良好的MCF-7 细胞接种于10 cm 培养皿，待细胞生长密度达到80%左右时，更换含IBC（40 μmol/L）或等体积DMSO的新鲜培养液，继续培养24 h。到达作用时间后终止培养，吸除培养液，经消化、离心收集细胞。加入预冷的PBS，置于4 ℃离心机离心5 min，弃去上清液，加入固定液（2.5%戊二醛）固定细胞，低温保存，委托武汉赛维尔公司进行后续处理并通过透射电镜观察、拍照记录给药后细胞亚显微结构。

2.5 IBC对线粒体功能的影响

将MCF-7细胞按2×10个密度接种于6孔板过夜贴壁后，处理不同浓度的IBC（10、20、40、80 μmol/L）。继续培养3 h后，吸除培养液，并用PBS清洗。每孔加入JC-1 染色工作液和培养液各1 mL，充分混匀，放置细胞培养箱中孵育20 min。在孵育期间，按照说明书要求配制适量的JC-1染色缓冲液，并放置于冰浴。孵育结束后，吸除上清液，用JC-1染色缓冲液清洗2次，并加入2 mL的细胞培养液，置于荧光显微镜下观察，拍照记录结果。

3 讨论

化疗药物（如紫杉醇、阿霉素等）在临床上对乳腺癌具有一定的治疗效果，然而肿瘤的耐药性和化疗药物毒副反应的出现将导致患者对化疗药物“可耐受的最大剂量”不断降低，甚至被迫中断化疗。因此，如何让化疗药物增效减毒是目前肿瘤化疗中需解决的另一个关键问题。天然产物具有结构多样性和低毒性的独特优势，从中寻求安全、有效的治疗药物用于克服乳腺癌细胞耐受与降低毒副反应不失为乳腺癌治疗研究的一个亮点。我国中药/天然药物资源非常丰富，且几千年

大脑通过观察、触摸，以及实践经验得到的一种能思考物体形状、结构、大小、轻重、质地、位置关系的思维能力。

关于程序性细胞死亡（PCD）机制的研究一直是生命科学领域所关注的热点之一，尤其在癌症的发生、发展和治疗中扮演着重要角色，特异性地诱导癌细胞发生PCD成为治疗癌症的主要策略之一，如凋亡、自噬等。我们采用流式细胞术和荧光显微镜检测IBC作用于乳腺癌细胞后的凋亡率，结果显示IBC对MCF-7细胞具有促凋亡作用，且呈现浓度依赖性。凋亡作为最经典的PCD方式，在维持肿瘤细胞增殖与死亡的动态平衡中发挥着关键作用，在这过程中Bcl-2家族蛋白扮演者重要角色，特别是Bax/Bcl-2比值变化能够反映出细胞存活和凋亡的平衡关系。本研究中，天然产物IBC能显著上调MCF-7细胞内促凋亡蛋白Bax表达水平，同时下调抑凋亡蛋白Bcl-2的表达，使Bax/Bcl-2比例显著升高，从而诱导MCF-7细胞发生凋亡。

所有患者均于入室后常规面罩吸氧 （2 L/min），于手术操作开始前15 min静脉注射地佐辛（生产批号：，规格1 mL:5 mg）5 mg，并于手术开始前5 min静脉注射丙泊酚(生产批号：H20030115，规格 20 mL:0.2 g)2 mg/kg。患者入睡后，持续泵注丙泊酚 4～6 mg/（kg·h），瑞芬太尼0.1～0.2 μg/（kg·min）。 手术仪器采用德国 Wolf宫腔镜电切系统术，术中注入5%葡萄糖溶液膨宫，膨宫压力为80 mmHg，进液速度为200 mL/min。

Akt为一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，又称蛋白激酶B，是细胞内PI3K/Akt信号通路传导的核心。多种药物、信号蛋白、生长因子等可通过Akt 蛋白Thr308 和Ser473位点的磷酸化，激活Akt及其信号通路调节下游相关分子，对肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭与转移等产生作用。免疫印迹实验结果显示，IBC 显著降低MCF-7细胞内的Akt及p-Akt-473蛋白表达水平，进而可能抑制PI3K/Akt 信号通路的传导，发挥促凋亡作用。另外，用凋亡抑制剂z-VAD-fmk预处理MCF-7后，IBC诱导的细胞死亡被部分保护，而Nec-1（程序性坏死抑制剂）没有保护作用，进而证实了IBC诱导的细胞死亡方式为凋亡。

有些时候，凋亡的发生伴随着细胞自噬，它们之间的关系复杂，自噬对细胞凋亡产生积极或消极的作用，即自噬在肿瘤细胞中常常产生存活和死亡的双重调控作用。自噬，也称为II型PCD，在细胞生存、代谢、应激适应、免疫及抗衰老等方面起着重要的生理作用。微管相关蛋白1轻链3（LC3）蛋白作为自噬发生的生物标志物之一，发生自噬时胞浆型LC3-I被酶解掉一小段多肽，转变为膜型LC3-II，即LC3-II/I比值的大小可推测自噬水平的高低。本研究中，我们使用IBC处理MCF-7细胞后，通过电镜观察到自噬小体的产生。同时，免疫印迹法实验中发现自噬相关蛋白p62、LC3-II/I的比值上调，证实了IBC诱导MCF-7细胞发生自噬。进一步，用自噬抑制剂CQ预处理细胞后，发现抑制自噬增加了MCF-7细胞对IBC的敏感性，说明细胞自噬保护了乳腺癌MCF-7细胞的存活。

重介质旋流器本身没有运动部件，物料在旋流器中实现分选的关键是介质泵所施加的能量产生了合适的离心力场，可以说介质泵是重介质旋流器的动力源。

线粒体是细胞产生能量的重要细胞器，也是ROS产生和作用的主要部位。研究表明，线粒体功能障碍具体表现为ATP生成减少，导致细胞内的ROS水平升高，使氧化应激和抗氧化之间平衡被打破，导致线粒体膜损伤，从而诱导细胞死亡。此外，ROS作为第二信使参与调控HIF-1α、PI3K/Akt、NF-κB、AMPK、PKM2 等信号通路，参与肿瘤细胞的增殖、凋亡、自噬及侵袭等多个生物学过程。本研究结果证实了IBC诱导乳腺癌MCF-7细胞死亡与线粒体功能变化密切相关，即IBC导致细胞内ATP水平下降、线粒体膜电位降低、产生和累积大量的ROS，从而诱导MCF-7细胞发生凋亡和自噬。

综上所述，天然产物IBC 能显著抑制人乳腺癌MCF-7细胞增殖、诱导发生细胞凋亡和自噬，其机制可能为上调Bax、p62和LC3-II的表达、下调Bcl-2、Akt、p-Akt-473 及LC3-I 的表达，且细胞内产生和积聚大量ROS，从而诱导细胞程序性死亡。然而，IBC的体内抗乳腺癌作用以及可能存在的潜在毒副作用有待进一步研究。