柴胡桂枝汤加减方联合卡培他滨抑制三阴性乳腺癌裸鼠皮下移植瘤的生长：基于抑制IL-6/STAT3信号通路

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，根据全球癌症统计，2020年乳腺癌发病率在新增癌症病例中占11.7%，已超越肺癌成为全球癌症发病率最高的癌种。三阴性乳腺癌（TNBC）是其中一种亚型，病理表现为雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人表皮生长因子受体2（HER2）均呈阴性，由于缺乏内分泌治疗和靶向治疗的靶点，具有复发率和转移率高、恶性程度高、侵袭性强等特点。目前，手术和化疗仍是TNBC患者最主要的治疗方式，但化疗耐药、复发转移及药物不良反应大大影响了其治疗效果。卡培他滨是一种氟尿嘧啶类药物，是临床上治疗肿瘤常用的化疗药物，有较好的抗肿瘤作用，但其不良反应多，预后较差。中医药因增强免疫，抗癌效果好，副作用小的优势，在肿瘤的预防和治疗中发挥着不可替代的作用。柴胡桂枝汤出自张仲景《伤寒论》，在治疗乳腺癌方面具有良好的临床疗效。已有研究证实柴胡剂联合化疗药物能有效的抑制乳腺癌细胞生长，促进癌细胞凋亡，然而柴胡桂枝汤联合卡培他滨治疗三阴性乳腺癌的机制研究尚未见文献报道。

IL-6/STAT3信号通路在炎症、肿瘤疾病中发挥着重要作用。有研究发现，抑制IL-6/STAT3信号通路可抑制多种恶性肿瘤的生长和转移。乳腺肿瘤微环境中的炎症因子白细胞介素-6（IL-6）与受体结合后，引起转录激活因子3（STAT3）的磷酸化激活，并进入细胞核，使癌症驱动基因异常表达，造成“炎-癌”转化，因此，IL-6/STAT3 信号通路可能是治疗三阴性乳腺癌的重要靶标。为了探究柴胡桂枝汤联合卡培他滨对三阴性乳腺癌细胞生长及凋亡作用与IL-6/STAT3信号通路的相关性，本研究通过建立MDA-MB-231人乳腺癌细胞裸鼠移植瘤模型，检测IL-6、STAT3 mRNA的表达，及IL-6/STAT3信号通路相关蛋白IL-6、STAT3，磷酸化（p）-STAT3 及其下游促凋亡蛋白B 细胞淋巴瘤-2 相关X（Bax），抗凋亡蛋白B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2），细胞周期蛋白D1（CyclinD1）表达的影响，讨论其作用机制，为相关临床治疗提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 细胞株与动物

人三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231，购自中国科学院上海生命科学研究所。健康SPF级BALB/c-nu雌性裸鼠60只，4～5周龄，体质量（18±2）g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号:SCXK（湘）2019-0004，经重庆医科大学实验动物中心（许可证号:SYXK（渝）2018-0003）IVC级动物房饲养。标准裸鼠饲料，自由摄食和摄水，裸鼠适应环境1 周后进行实验。本研究动物实验获得重庆医科大学医学研究伦理委员会审查批准。

（3）STA通过信道1（AP1使用的信道）向AP1发送802.11解除关联信息，解除STA与AP1间的关联。

1.2 药物

柴胡桂枝汤加减方（CHGZD）：柴胡24 g，桂枝9 g，黄芩9 g，炙甘草6 g，清半夏15 g，白芍9 g，蒲公英12 g，夏枯草12 g，生麦芽12 g，预知子12 g，生姜9 g，大枣6枚。购于重庆医科大学第一附属医院中药房。中药饮片经重庆医科大学中医药研究室何先元教授鉴定均为正品。加入10倍药材质量的水浸泡2 h，武火烧开后转文火1 h，煎液用双层纱布过滤，重新加水煎第2次，操作同前。把两次煎液混合后加热浓缩至含生药量2 g/mL。卡培他滨片（希罗达），上海罗氏制药有限公司生产，批号：H20073024。

1.4.5 ELISA检测血清中细胞因子IL-6水平 用3%戊巴比妥钠麻醉裸鼠后从眼眶取血，静置30 min，再以3000 r/min离心20 min，取上层血清。参考试剂盒说明书，用ELISA检测血清中IL-6水平。

1.3 主要实验试剂及仪器

特级胎牛血清、DMEM 高糖培养基（Vivacell）；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、BCA蛋白浓度测试盒（碧云天）；HE染液、多聚甲醛固定液、磷酸化蛋白抑制剂（赛维尔）；小鼠白细胞介素6 ELISA 试剂盒（江苏晶美）；RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒和Real-time反应试剂盒（Promega）；兔抗STAT3抗体、兔抗p-STAT3抗体（针对705位酪氨酸磷酸化位点）、兔抗GAPDH抗体（SAB）；兔抗IL-6抗体、兔抗Bax抗体、兔抗Bcl-2抗体、兔抗CyclinD1 抗体、山羊抗兔IgG（CST）；Realtime PCR 引物序列由北京擎科公司合成，见表1；Synergy HTX 全型自动酶标仪（Thermo Fisher Scientific）；CFX96型Touch Real-time PCR仪（Bio-Rad）。

1.4 实验方法

1.4.1 动物造模 用含10%胎牛血清DMEM完全培养基在细胞培养箱中培养MDA-MB-231细胞（培养条件为5%CO、37 ℃）。收集对数生长期MDA-MB-231细胞，胰蛋白酶消化后用预冷的无血清培养基重悬制备成单细胞悬液，调整细胞浓度至4×10/mL，在超净台内对60只裸鼠进行接种。细胞吹打均匀后用1 mL空针将细胞悬液原位注射于裸鼠右侧第4乳房垫下，每只0.1 mL。3～5 d后探查肿块情况，以造模后第5天小鼠接种部位可触摸到结节为造模成功标准。

模型对照组裸鼠出现体质量明显下降，摄食量减少，精神状态较差，反应迟钝，活动量减少等虚弱状态。柴胡桂枝汤加减方低剂量组和卡培他滨组出现不同程度的体质量下降、摄食量减少等情况，整体状态好于模型对照组。柴胡桂枝汤加减方中、高剂量组及联合组饮食良好，精神状态较好，反应灵敏，体质量有所增加。

1.4.3 观察荷瘤鼠一般状态、测瘤体积、称瘤质量并计算抑瘤率 给药期间观察荷瘤鼠的一般生长状况，如饮食状况、精神状态、活动状况以及肿瘤生长情况。肿瘤组织取出后，测瘤体积：用游标卡尺分别测量瘤体的最长径（a）和最短径（b），依据公式：V=ab/2计算肿瘤体积，称瘤质量并按照公式计算抑瘤率，抑瘤率（%）=（对照组平均瘤质量－给药组平均瘤质量）/对照组平均瘤质量×100%。

1.4.2 分组及给药 60只裸鼠全部成瘤，成瘤率100%。将60只荷瘤鼠随机分为6组，每组10只，分别是：模型对照组（MO），CHGZD低、中、高剂量组（CL，CM，CH），卡培他滨组（CP），联合组（CH+CP）。待皮下移植瘤瘤体积达75～100 mm时开始给药治疗，给药剂量根据《药理实验方法学》折算。成人体质量按60 kg估算，成人向小鼠的用药换算系数为9.01，每剂含生药量141 g，以此换算出中药低剂量组小鼠生药用量为10.62 g/kg/d，相当于成人等效剂量的一半，中药中剂量组小鼠生药用量为21.23 g/（kg·d），相当于成人等效剂量，中药高剂量组小鼠生药用量为42.46 g/（kg·d），相当于成人等效剂量的两倍。成人卡培他滨的用药剂量2 mg/d，换算出阳性药物组小鼠卡培他滨每日用量为0.2 mg/kg体质量。模型组给予等体积双蒸水，各组按0.1 mL/10 g折算给药体积。每组均连续给药21 d。末次给药后禁食过夜，3%戊巴比妥钠麻醉下采血供血液生化检测用，处死动物，迅速取出肿瘤组织，拍照称质量后切成约3 mm×5 mm×5 mm的瘤块，大部分装入冻存管，置于-80 ℃冰箱保存，另外一部分用4%多聚甲醛固定48 h后石蜡包埋。

1.4.4 苏木素-伊红（HE）染色观察各组肿瘤组织病理学变化 将部分肿瘤组织置于4%多聚甲醛溶液中固定，石蜡包埋、切片，常规HE染色，切片脱水、透明、封片，显微镜观察肿瘤组织细胞病理形态学变化。

The aim of this study was to determine whether the interval time between preoperative neoadjuvant CRT and surgery affected the rates of pCR, perioperative surgical complications, sphincter-saving surgery, DFS and OS in locally advanced mid-or distal rectal cancer.

1.4.6 实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测各组肿瘤组织中IL-6、STAT3、Bax、Bcl-2和CyclinD1 mRNA的表达 取冻存肿瘤组织30 mg于RNA裂解液中，用组织匀浆器研磨组织成匀浆，提取总RNA，使用超微量分光光度计测量总RNA的纯度和浓度。按照试剂盒说明书将上述提取的总RNA逆转录为cDNA，逆转录程序为退火25 ℃，5 min；延伸42 ℃，1 h；逆转录酶失活70 ℃，15 min。进行PCR 扩增反应，扩增条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火1 min，60 ℃延伸15 s，40个循环，于60～95 ℃生成溶解曲线，以GAPDH为内参，采用2法计算。

与模型对照组比较，卡培他滨组、柴胡桂枝汤加减方低、中、高剂量组及联合组IL-6、STAT3、Bcl-2 和CyclinD1 mRNA 显著降低（＜0.05，＜0.01），Bax mRNA显著升高（＜0.01）；与卡培他滨组比较，柴胡桂枝汤加减方低、中、高剂量组及联合组IL-6、STAT3、Bcl-2和CyclinD1 mRNA显著降低（＜0.05，＜0.01），柴胡桂枝汤加减方高剂量组及联合组Bax mRNA显著升高（＜0.01，表4）。

1.4.8 统计学方法 采用SPSS 24.0 软件进行统计分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，多组均数比较采用单因素方差分析，随后的两两比较采用LSD-检验。＜0.05为差异具有统计学意义。

教学手段包括课本、演示文稿、讲座、文章研读、在线学习单元模块、做项目、同学间进行小组讨论、在线参与班级讨论并对至少两位同学的发言进行点评、回复等，还有案例分析。每周至少要就该门课投入九小时以上的学习时间。教学模式是以学生为中心的教师引领辅助型，充分发挥学生的主动性、责任心和创造力。要求学生每周登录教学软件（Canvas），完成在线学习任务并提交作业,教师线上线下对学生的提问、讨论和问题解决方案给出积极正面的反馈意见。

2 结果

2.1 对各组裸鼠一般情况的影响

莫颖宁（1975-），女，广西柳州人，经济学博士，山东中医药大学副教授，研究方向：医药经济与药事管理。

2.2 对各组裸鼠肿瘤体积、皮下移植瘤瘤重及抑瘤率的影响

与模型对照组比较，柴胡桂枝汤加减方低、中、高剂量组，卡培他滨组及联合组肿瘤体积与皮下移植瘤瘤质量均降低（＜0.01）；与卡培他滨组比较，柴胡桂枝汤加减方低、中、高剂量组及联合组肿瘤体积与皮下移植瘤瘤质量均降低（＜0.01），柴胡桂枝汤加减方中、高剂量组及联合组抑瘤率显著升高（＜0.01），且柴胡桂枝汤加减方低剂量组、卡培他滨组、柴胡桂枝汤加减方中剂量组、柴胡桂枝汤加减方高剂量组、联合组的肿瘤抑制率依次升高（图1，表2）。

2.3 对各组裸鼠肿瘤组织病理形态的影响

模型对照组中，肿瘤组织细胞密集，形态各异，未见明显肿瘤坏死灶。柴胡桂枝汤加减方低剂量组和模型对照组差别不大；中、高剂量组及联合组肿瘤组织出现了不同程度的肿瘤细胞退变，肿瘤细胞密度明显减少，并可见细胞核碎片，其中联合组组肿瘤细胞退变变化最显著；卡培他滨组也出现一定程度的肿瘤细胞退变，密度变小（图2）。

2.4 对各组裸鼠血清中IL-6水平的影响

与模型对照组相比，柴胡桂枝汤加减方各给药组IL-6蛋白水平显著降低（＜0.01），高剂量组及联合组STAT3、p-STAT3、p-STAT3/STAT3、Bcl-2和Cyclin D1蛋白水平显著降低（＜0.05，＜0.01），高剂量组及联合组Bax 蛋白水平显著升高（＜0.05）；与卡培他滨组相比，柴胡桂枝汤加减方各给药组IL-6蛋白水平显著降低（＜0.05，＜0.01），联合组STAT3、p-STAT3、p-STAT3/STAT3、Bcl-2和Cyclin D1蛋白水平显著降低（＜0.05，＜0.01），联合组Bax蛋白水平显著升高（＜0.05，图3～5）。

2.5 对各组裸鼠肿瘤组织中IL-6、STAT3、Bax、Bcl-2和CyclinD1 mRNA表达的影响

1.4.7 Western blot检测各组肿瘤组织中IL-6、STAT3、p-STAT3、Bax、Bcl-2和CyclinD1蛋白的相对表达水平快速剪取50 mg于-80 ℃冻存的瘤组织，加入含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，置于研磨器中研磨组织成匀浆，4 ℃下以12 000 r/min离心10 min，提取组织总蛋白。BCA蛋白质检测试剂盒用于测量蛋白质浓度。用10%SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶分离等量的蛋白质，然后转移到PVDF膜上。TBST冲洗后用脱脂牛奶常温封闭2 h，一抗4 ℃摇床过夜，加二抗常温孵育2 h。通过ECL化学发光试剂检测蛋白质信号，并使用Image J软件分析条带灰度值，GAPDH作为内参，计算各蛋白相对表达水平。

2.6 对各组裸鼠肿瘤组织中IL-6、STAT3、p-STAT3、p-STAT3/STAT3、Bax、Bcl-2和CyclinD1蛋白表达的影响

与模型对照组比较，柴胡桂枝汤加减方低剂量IL-6水平降低（＜0.05），卡培他滨组、柴胡桂枝汤加减方中、高剂量组及联合组IL-6水平显著降低（＜0.01）；与卡培他滨组比较，柴胡桂枝汤加减方低、中、高剂量组及联合组IL-6水平显著降低（＜0.01，表3）。

但无论如何必须尊重科学，因为在科学中也有可怕的“瘙痒”，人极为强烈地喜欢给科学“搔痒”，因此毫无办法，需要这种科学，也需要这种评论，需要您所如此鄙视的“扳着指头计算”，让科学参与生活和“舒适的角落”的建造，让生活坐在椅子上，但椅子只是一条腿而非全部四条腿都支撑在科学上。 那时，“世界的理智之光”就突然放出光芒，这光芒来自这种谦逊的、对人很温和的科学……[2]494

3 讨论

乳腺癌在中医属于“乳岩”“乳石痈”等范畴。在TNBC中，只有1/5的侵袭肿瘤类型表现出化疗敏感性，而现代研究表明，中药在逆转肿瘤化疗耐药性、改善调养机体以及化疗药物所致的机体伤害、抑制乳腺癌的转移和增殖，阻滞乳腺癌细胞周期以及诱导癌细胞发生凋亡方面具有独特的优势。柴胡桂枝汤原方由小柴胡汤和桂枝汤相加而成，不仅具有小柴胡汤和解少阳、疏肝解郁的作用，还兼具桂枝汤调和营卫、气血、阴阳的作用。本实验在原方的基础上去人参避免补益太过，闭门留寇；加入蒲公英清热解毒；夏枯草清肝泻火；生麦芽消食健胃；预知子疏肝理气，软坚散结，合为柴胡桂枝汤加减方，以加强其调和气血，抗炎解毒及抗肿瘤的功效。据文献报道，在NACT中，应用紫杉醇与（或）蒽环类药物没有实现P CR的HER2阴性乳腺癌患者，行卡培他滨辅助化疗，可获得理想疗效，并且在安全性方面具备可控性，同时能够使OS以及DFS得到大幅改善。因此，本研究将柴胡桂枝汤加减方与卡培他滨联合，并研究其作用机制。

导游韩语教材的首要职能是满足本土旅游市场需求，为地方社会培养合格的韩语导游人才。这就决定了该类教材要结合本土文化特点，收集真实、准确的语料信息，融入更多具有代表性的本土文化元素，为学习者提供真实的语言环境，使之成为能够彰显地域文化的优秀本土教材，从而强化学生对本土文化知识的储备，激发其传播本土文化的热情。

本研究结果表明，中药组和联合组乳腺癌荷瘤裸鼠在进食状况，精神状态和活动量上均好于模型对照组，体质量也有所增加；与模型对照组比较，柴胡桂枝汤加减方低、中、高剂量组，卡培他滨组及联合组肿瘤体积与皮下移植瘤瘤重均降低；此外，柴胡桂枝汤加减方低剂量组、卡培他滨组、柴胡桂枝汤加减方中剂量组、柴胡桂枝汤加减方高剂量组、联合组的肿瘤抑制率依次升高。肿瘤组织病理学显示，柴胡桂枝汤中、高剂量组及联合组肿瘤组织出现了不同程度的肿瘤细胞退变，肿瘤细胞密度明显减少，并可见细胞核碎片，其中联合组组肿瘤细胞退变变化最显著，表明柴胡桂枝汤加减方能抑制肿瘤的生长，与卡培他滨联用，具有协同抗肿瘤的作用，效果更佳。

L-6/STAT3信号通路在炎症、肿瘤疾病中发挥着重要作用。IL-6是一种炎症因子，主要作用为诱导T、B细胞的分化及促进造血功能等，但IL-6亦可抑制免疫系统，刺激肿瘤细胞新生血管的形成，参与了肿瘤的发生与发展。IL-6促使肿瘤发生发展最主要的方式是激活STAT3表达，STAT3通常以非活化形式存在于细胞质中，当细胞受到刺激时，IL-6等炎性因子可通过与细胞膜受体结合，作用于gp130蛋白，激活非受体酪氨酸激酶（JAK），进而磷酸化修饰STAT3 蛋白分子；p-STAT3以二聚体形式转入细胞核，调控癌基因表达。研究发现，当细胞受到异常的信号刺激下，STAT3的酪氨酸基团被激活成P-STAT3，P-STAT3离开受体通过分子间的SH2区与酪氨酸磷酸化位点Y705的相互作用，在细胞质内相互两两结合形成二聚体，随后P-STAT3蛋白二聚体迅速转位入核，结合并诱导与细胞凋亡等密切相关的下游基因异常表达。IL-6/STAT3信号通路与肺癌、乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌等恶性肿瘤的发生与发展密切相关，IL-6介导的STAT3活化后能够明显上调恶性肿瘤细胞的增殖、分化，抑制Bcl-xl、Survivin、CyclinD1等细胞凋亡基因的表达，发挥抗细胞凋亡的生物学作用。Bax、Bcl-2、CyclinD1是近年来研究发现的与细胞凋亡进程明显相关的基因，其中Bax发挥促进细胞凋亡的作用，Bcl-2和CyclinD1发挥抗细胞凋亡的作用。本研究结果显示，与模型对照组相比，中药组和联合组肿瘤组织IL-6、STAT3 mRNA及蛋白表达水平明显降低（＜0.05，＜0.01），其中p-STAT3/STAT3表达水平的降低说明柴胡桂枝汤能够降低三阴性乳腺癌裸鼠磷酸化STAT3的表达。其下游基因Bcl-2和CyclinD1 mRNA和蛋白表达在中、高剂量组及联合组中显著降低（＜0.01），Bax mRNA和蛋白表达在高剂量组及联合组中显著升高（＜0.01），这可能与药物的量效关系相关，此外，细胞凋亡同时受NF-kB等多个信号通路调节，药物低浓度时Bcl-2、CyclinD1和Bax没有明显改变还可能与其他信号通路调节相关。这提示柴胡桂枝汤加减方联合卡培他滨可以通过调节IL-6/STAT3信号通路促进肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞生长。

综上所述，柴胡桂枝汤加减方与卡培他滨联用可明显抑制三阴性乳腺癌裸鼠体内肿瘤的生长，其作用机制可能为抑制IL-6/STAT3信号通路，调控Bax、Bcl-2 和CyclinD1基因表达抑制细胞的增殖和分化，诱导细胞凋亡，从而发挥抗肿瘤作用。这为临床上采用中药复方治疗三阴性乳腺癌更好地提供实验依据，为中西医结合防治恶性肿瘤提供新思路、新方法。