肝细胞癌进展过程中的关键基因ATP1B3和ENAH的筛选与鉴定：基于数据挖掘和临床验证

肝细胞癌（HCC）是一个主要的全球健康问题和死 亡原因。据世界卫生组织估计，到2030年，将有超过100 万人死于HCC，与其他癌症相比，HCC 发病率在2020年继续以更快的速度上升。这种癌症的主要病因包括代谢紊乱、肝炎病毒的慢性感染、吸烟和过量饮酒等。不管肝脏的病因如何，HCC与肝纤维化和肝硬化密切相关。HCC预后的一个重要部分取决于潜在的慢性肝病，这也是其发生的危险因素。肝硬化死亡率的Child-Pugh评分对于患者分层至关重要。大约80%～90%的HCC有潜在肝纤维化，大约三分之一的肝硬化患者会发展成HCC。由于早期临床症状不明显，发病机制不明，HCC确诊时通常为晚期或已发生远处转移，增加治疗难度，且预后较差。目前，常用的HCC诊断方法，如血清肿瘤标志物、影像学技术等临床效果并不理想。筛选与HCC早期诊断和不良预后相关的标志物，对于提高HCC的治疗效果和预后至关重要。随着多组学分析方法的应用，大量重要分子被发现并成功应用于临床诊断和治疗。但是，从肝纤维化进展到HCC是一个漫长的过程，其机制非常复杂，目前尚未发现能作为HCC进程的标记物。因此，我们通过生物信息学数据挖掘，着眼于HCC进程中各疾病表型之间的基因变化，找到与HCC进展相关的新基因，以期作为HCC的诊断和预后的新靶点。

1 材料和方法

1.1 数据集选择

从TCGA数据库（https://portal.gdc.cancer.gov/）下载374 个HCC 和50 个正常组织的表达谱，从GEO（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/database）获取HBV相关肝纤维化患者基因表达谱数据集GSE84044、正常与肝硬化相关数据集GSE14323、肝硬化与HCC相关数据集GSE63898。其中GSE84044数据集基于GPL570平台［HG-U133_Plus_2］Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array、GSE14323数据集基于GPL571平台［HG-U133A_2］Affymetrix Human Genome U133A 2.0 Array、GSE63898数据集基于GPL13667平台［HGU219］Affymetrix Human Genome U219 Array。

1.2 DEG的筛选

TCGA-LIHC数据集的DEG使用edge R包分析，GSE84044、GSE14323和GSE63898数据集的DEG使用在线工具GEO2R来识别。选择＜0.05，|FC|＞2作为TCGA-LIHC、GSE14323和GSE63898数据集DEG的截断值，＜0.05，|FC|＞1.3作为GSE84044 数据集DEG的截断值。

1.3 DEG的火山图、韦恩图绘制

使用ggplot2 R包绘制火山图和韦恩图。

1.4 DEG的富集分析

使用clusterProfiler R包对差异基因绘制GO分析，包括生物过程（BP）、细胞成分（CC）和分子功能（MF）以及KEGG通路分析。＜0.05被认为差异具有统计学意义。

1.5 基因的差异表达和临床参数相关性分析

GO富集分析显示差异基因主要富集在细胞外结构组织，含细胞外基质的胶原蛋白，细胞外基质成分等方面。KEGG富集显示主要富集在黏着斑途径中（图2）。

1.6 RT-qPCR

本研究使用GEO2R分别对GSE84044数据集中肝纤维化组织、GSE14323数据集中正常与肝硬化组织、GSE63898数据集中肝硬化与HCC组织；使用edgeR包对TCGA-LIHC中正常与HCC组织按筛选标准（FC=1.3/2，＜0.05）进行差异基因分析（表1），分别得到了1972，912，1107，8975个DEG。使用火山图对各数据集差异基因进行可视化（图1A～D），取交集后得到了118个共同DEG（图1E）。

2 结果

2.1 不同肝脏相关疾病组别共同DEG筛选

收集来自广西医科大学附属肿瘤医院15对HCC组织和邻近癌旁组织。采样时间为2018年6月～2020年9 月。本研究获得广西医科大学伦理委员会批准（20200035）。所有患者均提供知情同意。Trizol试剂提取HCC组织和癌旁组织中的总RNA。用Takala反转录试剂盒（RR047A）将总RNA逆转录为cDNA，然后用Takala试剂盒（RR820A）进行RT-qPCR扩增。引物序列：ATP1B3正向5'-TCATCTACAACCCGACCACCG-3'，反向5'-GAGTCTGAAGCATAACCCACATC-3'；ENAH正向5'-TGACTATTGTGCTGTCTGCTGC-3'，反向5'-AAAGGTTCACTGCTGACTCCC-3'；ACTB 正 向5'-AGATCAAGATCATTGCTCCTCCTG-3'，反向5'-AG TCATAGTCCGCCTAGAAGCAT-3'。ATP1B3和ENAH的检测以β-Actin 作为内参。2法计算ATP1B3 和ENAH的相对表达水平。

2.2 DEG的富集分析

使用Wilcoxon 秩和检验对基因在各不同疾病类型中进行差异表达分析；基因与临床特征关系分析，计数资料采用卡方检验或Fisher's精准检验，连续资料采用检验；使用logrank检验对基因在TCGA-LIHC数据集中进行生存分析，使用survminer包对生存结果进行可视化；使用pROC包绘制基因关于预测正常和肿瘤结局的ROC曲线图；使用单因素方差分析分析基因表达量与T分期、病理Stage和病理Grade关系，使用ggplot2 R包进行可视化。

ATP1B3 表达与T 分期和临床病理分期相关（＜0.05），而ENAH表达与病理分级相关（＜0.05，表3）。生存分析发现，ATP1B3和ENAH高表达与HCC患者不良预后有关（＜0.05，图4A、B）。ROC曲线分析表明ATP1B3 和ENAH，曲线下面积AUC 分别是0.821 和0.933，在预测患者为正常或肿瘤结局检验效能方面具有较高准确性（图4C、D）。接着我们分析了ATP1B3和ENAH的表达量与临床各分期和分级关系。从T分期、病理Stage和病理Grade来看，ATP1B3表达随着HCC疾病进展表达量逐渐升高。T3、T2分期ATP1B3表达量显著高于T1分期，Stage III、Stage II高于Stage I分期，Grade3分级高于Grade1（＜0.05，图4E～G）。ENAH高表达与HCC晚期病理Grade相关，Grade3、Grade2分级ENAH表达量显著高于Grade1（＜0.05，图4H～J）。

2.3 筛选DEG的核心基因

在本研究中，我们筛选了GEO数据库中3个数据集：肝纤维化数据集GSE84044、肝硬化相关数据集GSE14323、肝硬化与HCC 相关数据集GSE63898 和TCGA中肝细胞癌TCGA-LIHC数据集。取四个数据集DEG交集，我们获得了118个共同DEG。对DEG做GO和KEGG分析，发现DEG在细胞外基质组织、胶原蛋白三聚体、糖胺聚糖结合、黏着斑和AGE-RAGE通路中起重要作用。我们发现在上调基因中发现ROBO1、LAMC1、ATP1B3、SPP1、AKR1B10、ENAH 等基因在TCGA数据库中，其高表达与HCC患者不良预后相关（＜0.05）。通过Pubmed文献检索，发现ROBO1作为分泌蛋白Slit2的受体，通过Slit2-Robo1信号通路激活肝星状细胞，从而促进肝损伤和纤维化。Song等在HCC组织和细胞中检测Robo1的水平，发现Robo1被上调。Qin等发现层粘连蛋白γ1（Lamc1）在肝细胞癌组织中上调，体外实验推测Lamc1 可能通过PTEN/AKT途径调节PKM2表达而参与HCC的进展。分泌型磷蛋白1（SPP1）参与编码骨桥蛋白（OPN），OPN在肝纤维化和肝硬化等慢性肝脏疾病中起关键作用表达上调。Zhu等检测170例HCC患者和120例健康体检者血清醛酮还原酶1B10（AKR1B10）水平，发现HCC患者血清AKR1B10水平显著高于健康对照组,联合血清AFP检测可提高肝癌的诊断率。AKR1B10被认为是一种新的HCC血清学生物标志物。

2.3 核心基因与临床特征关系

购买坚果时，注意看看有无发霉长虫，炒货要看看有没有烧煳，烧煳的坚果既产生了有害物质，又使营养价值大打折扣。而且最好选择原味的坚果。

2.4 ATP1B3和ENAH在临床样本中的验证

同场PK：将葛兰许和Bin 707放在一起PK是极其不公平的，这里不过是想比较一下两款酒的风格而已，因为Bin707近年价位越来越逼近葛兰许，是Penfolds众多红葡萄酒中最为强壮、饱满的代表。707充满力量，却不会让你觉得太霸道，浓郁的黑浆果香，入口复杂的香料香和更多层次的香气。葛兰许要深沉和沉稳很多，它是一款你得要品尝到第三口才能喝明白的年份，刚开始有很多你无法形容的感受。

收集来自广西医科大学附属肿瘤医院15对HCC及邻近癌旁组织样本，提取总RNA，接着对ATP1B3和ENAH在HCC组织及癌旁组织的表达进行了RT-qPCR实验。可能由于样本数较少，暂未发现这两个基因与HCC临床特征有显著关系（表4）。RT-qPCR实验发现，ATP1B3和ENAH在HCC组织表达高于癌旁组织（＜0.05，图5），可作为诊断HCC的良好指标。

3 讨论

HCC是一种严重的全球健康负担，其发生和发展的潜在机制很复杂，是全球癌症相关死亡的常见原因。目前，尽管HCC在系统治疗方面取得了进展，但由于诊断晚和频繁潜在的肝脏疾病，患者的生存率仍然很低。尚不清楚不同形式的肝炎和肝损害是如何引发HCC的。因此，确定共同的致病基因对早期HCC的检测和预防非常重要。随着多组学技术的应用，生物标志物已成为诊断、预后和治疗的有力工具。尽管，许多与HCC不同发生阶段相关的关键分子被筛选出来，成为HCC早期筛查和治疗的靶点。但是，肝细胞癌发生过程中的共同基因的研究，尚未见报道。

对118个DEG在TCGA-LIHC数据集表达情况进行验证。发现除9个无明显差异外，95个DEG在HCC组织下调（＜0.05），14 个DEG 在HCC 组织上调（＜0.05，表2）。为了能筛选出与HCC进展相关并且能成为疾病恶化程度的预后指标，结合Pubmed文献检索，在上调基因中选择ATP1B3和ENAH这2个研究很少的基因。接着对ATP1B3和ENAH分别做了在不同肝脏疾病类型数据集中的表达差异分析，发现ATP1B3在恶性疾病中表达较高，特别在癌前病变肝硬化时期表达更高（图3A），ENAH随着疾病进展加剧，其表达逐渐增高（图3B）。

目前，ATP1B3和ENAH与HCC进程相关的研究非常少。ATP1B3编码Na+/K+-ATPase的β亚基，Na+/K+-ATPase不仅参与正常的细胞活动，在致癌过程中也至关重要。Li等发现ATP1B3在胃癌组织中高表达，可通过PI3K/AKT通路调节胃癌细胞的进展和预后。Zhang等通过综合数据集多转录组学、蛋白质组学分析，发现ATP1B3在HCC中高表达，且与生存和免疫浸润相关。体内功能分析发现ATP1B3参与HCC的增殖、迁移和转化。预测ATP1B3可作为HCC诊断和潜在治疗靶点。ENAH是一种肌动蛋白调节蛋白，参与控制细胞运动和细胞-细胞黏附。ENAH在多种癌症中包括食管癌、胃癌和乳腺癌中过表达，Deng等结合数据库分析和体外细胞实验发现ENAH可通过Notch 信号通路促进肝癌细胞的增殖、侵袭和迁移。ENAH可逆转miR-139-5P对肝癌细胞的抑制功能作用，诱导肝细胞癌的恶性进展。本研究通过收集各肝脏疾病相关数据集分析，发现ATP1B3和ENAH在正常组织、低纤维化、高纤维化、肝硬化、HCC组织中其表达量随着疾病进展大体上调，但ATP1B3在肝硬化阶段表达最高。

在之前的课程中，已经学习了C、G、D、A调的五指音阶，这些音阶均由“秘密公式”“全音—全音—半音—全音”的结构构成，即为大调音阶。在大调音阶的基础上，将五指音阶中的三音降低半音，即成为小调音阶，它的结构为“全音—半音—全音—全音”。由此，学生便轻松地掌握了C、G、D、A大调及其同主音小调的五指音阶。至此，移调训练不仅可以在大调之间相互转换，也可以在大调与小调之间进行，同时，也帮助学生建立大调与小调的调性听觉及理论认知能力，使这一模式的学习更加清晰和直观。

生存分析发现，ATP1B3和ENAH在TCGA-LIHC数据集中，基因的高表达HCC患者生存率低，有不良预后。ROC曲线分析ATP1B3和ENAH在诊断正常或肿瘤结局检验效能方面，ENAH AUC高达0.933，ATP1B3为0.821，具有较高检验效能。接着我们分析了ATP1B3和ENAH与HCC患者各临床参数之间关系，发现ATP1B3随着T分期、病理Stage和Grade进展，其表达量逐渐增高。ENAH在晚期病理Grade中，其表达量更高。以上说明ATP1B3和ENAH密切参与肝细胞癌的进展过程，可作为肝细胞癌预后和诊断标记物。最后我们收集到15 对肝细胞癌和邻近癌旁组织，对ATP1B3 和ENAH 做RT-qPCR 验证。研究发现ATP1B3和ENAH mRNA在癌组织表达上调。

参照组:该组患者予以四联疗法,使用的药物为兰索拉唑,使用剂量为15mg,一天2次,阿莫西林,使用剂量为1000mg,一天2次,左氧氟沙星,使用剂量为200mg,一天2次,枸橼酸铋钾,使用剂量为220mg,一天2次。

综上所述，我们通过生物信息学方法挖掘出从肝纤维化、肝硬化到HCC疾病进程中，表达逐渐上调且与HCC 患者生存、预后、进展和诊断密切相关基因：ATP1B3和ENAH，并通过收集临床样本验证了其在肝癌组织的高表达，可以为HCC诊断和预后提供新的靶点和治疗方向。

社会认知两大基本维度对中庸思维三因子分别的回归分析显示，能动性对三因变量均不具有显著预测作用，而社群性的预测作用均为极显著，其中，对多方思考的预测率为18%(F=27.66，p<0.001)；对整合性的预测率为6%(F=7.98，p<0.001)；对和谐性的预测率为13%(F=18.95，p<0.001)。