兵团第十四师四十七团设施蔬菜根结线虫种类鉴定*

马少军，刘佳伟，金玉华，李克梅*

（1.新疆农业大学农学院，新疆 乌鲁木齐 830052；2.新疆生产建设兵团第十二师农业科学研究所）

根结线虫（Meloidogyne spp.）在世界各地广泛分布，寄主范围广，几乎能够侵染所有的蔬菜作物，常造成严重的经济损失[1]。迄今，全世界已报道100多种根结线虫，常见的根结线虫种类主要是南方根结线虫（Meloidogyn incognita）、爪哇根结线虫（M.javanica）、花生根结线虫（M.arenaria）与北方根结线虫（M.hapla）[2]。新疆兵团第十四师四十七团地处新疆较温暖的和田地区墨玉县，光热资源充足，冬季无严寒，开春早，降水少，具有发展设施农业得天独厚的自然条件。四十七团有设施大棚500 多座，主要种植番茄、辣椒和十字花科蔬菜，还有部分黄瓜、豇豆、芹菜等蔬菜。新疆地处中国西北边陲，冬季气候寒冷，并不利于根结线虫在室外越冬，很长时间以来，未见根结线虫在新疆大面积危害的报道。但设施农业的保温条件好、复种指数高、栽培模式单一，有利于土壤中根结线虫繁殖积累，为新疆设施作物根结线虫病的发生提供了适宜环境[3]，蔬菜根结线虫病已逐渐成为当前新疆设施蔬菜主要病害之一，严重影响蔬菜的产量和品质。

全俊仁[4]等首次发现在新疆石河子温室中北方根结线虫（M.hapla）侵染危害辣椒。杜兰英[5]等报道根结线虫病在新疆哈密危害大棚、温室的黄瓜、番茄、茄子等蔬菜，并提出病害防治建议，但未明确根结线虫的种类。李克梅[6]等报道新疆阿克苏、吐鲁番和库尔勒等地区危害蔬菜的为南方根结线虫与北方根结线虫的混合种群。本研究鉴定了根结线虫病新发生地四十七团设施蔬菜根结线虫的种类，研究结果可为该地蔬菜根结线虫病的来源追溯及其病害综合防控提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

2020年9月至2021年5月在第十四师四十七团大棚中采集4批15份蔬菜根结线虫病病株（其中番茄8份，豇豆2份，黄瓜3份，芹菜2份），流水清洗干净，放置于4 ℃冰箱中备用，从每个病株中随机挑取20个白色雌虫和20个卵囊，以备后续使用。

1.2 根结线虫会阴花纹的观察

雌虫会阴花纹玻片的制作参照谢辉[7]的方法，即在解剖镜下，滴加45%乳酸至载玻片中央做浮载剂，将根结线虫成熟雌虫移入其中，用手术刀切取虫体后部角质膜，清除内部附着物，再将其移至另一滴干净的45%乳酸液滴中清洗和修正，加盖玻片，置显微镜下观察拍照。将观察的会阴花纹形态特征与文献资料对比，初步鉴定根结线虫种类。

1.3 常见根结线虫特异性引物PCR检测鉴定

1.3.1 单条线虫DNA的提取

解剖镜下挑取孵化的单条根结线虫二龄幼虫放入含有8 μL ddH2O的PCR管中，继而置液氮冰冻2 min，65 ℃温育1 min，重复3个循环后，再加入1 μL蛋白酶K和1 μLBuffer，65 ℃保温90 min，95 ℃加热10 min。得到的线虫DNA可用于进一步的PCR或于-20 ℃保存备用。

1.3.2 特异性引物PCR扩增鉴定常见根结线虫

对4种常见的根结线虫检测鉴定，分别采用Randig[8]等报道的特异性引物Inc-K14-F和Inc-K14-R检测南方根结线虫，Petersen[9]等报道的特异性引物Fh和Rh检测北方根结线虫，Fargette[10]等报道的特异性引物Far和Rar、Fjav和Rjav分别扩增检测花生根结线虫和爪哇根结线虫（表1）。统一采用25 μL的反应体系：12.5 μL 2×Easy Taq Mix，引物各2 μL，根结线虫DNA模板1 μL，ddH2O7.5 μL。扩增条件为：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s、退火温度（上述4种根结线虫分别是64 ℃、58 ℃、61 ℃、64 ℃）40 s、72 ℃延伸1.5 min，变性、退火、延伸循环反应40次，72 ℃保温10 min。电泳检测扩增产物，在紫外照胶仪上观察并拍照。

表1 本研究所用引物信息

2 结果与分析

2.1 发病症状

蔬菜根结线虫病从苗期到成株期均可发生。受害植株地上部生长缓慢，叶片变小，变黄。结实少，甚至不结实，果实发育缓慢，严重时植株停止生长，植株早衰。根结线虫寄生在蔬菜根内，病根部膨大，形成畸形根结，根结外部通常附着有大量胶质状卵囊（图1A）。解剖根结，可见近球形或长椭圆形的雌虫，雌虫有突出的短颈，乳白色，阴门和肛门位于末端，无尾（图1B）。

图1 番茄根结线虫病根症状及根结线虫雌成虫虫态

2.2 根结线虫的形态学鉴定

切取成熟雌虫的会阴花纹，在生物显微镜下观察，发现供试根结线虫会阴花纹背弓比较高，似乎方形；侧区侧线清楚、光滑，线纹断裂分叉形成刻痕；线纹由细到粗，呈“Z”形（图2）。与南方根结线虫（M.incognita）的会阴花纹相似[1]。

图2 供试根结线虫成熟雌虫会阴花纹

2.3 特异性引物PCR检测鉴定

用特异性引物PCR扩增检测采集保存的根结线虫群体，其中以Inc-K14-F/Inc-K14-R为引物（检测南方根结线虫）的样品中扩增出400 bp左右的条带，而引物Fh/Rh（检测北方根结线虫）、Far/Rar（检测花生根结线虫）和Fjav/Rjav（检测爪哇根结线虫）在不同的样品中均没有扩增出特异性条带（图3）。

图3 根结线虫经特异性引物扩增的电泳图谱

3 结论与讨论

本文通过比对根结线虫成熟雌虫的会阴花纹形态特征，结合特异性引物PCR扩增检测，将来自兵团第十四师四十七团的15个设施蔬菜根结线虫群体均鉴定为南方根结线虫，而未见其它根结线虫种类。

蔬菜根结线虫病在世界各地广泛分布危害。自然条件下，4种常见根结线虫中，北方根结线虫主要分布在寒温带地区，而其他3种则主要分布在热带地区，其中对农作物危害最严重的是南方根结线虫[11-12]。关于根结线虫的鉴定常采用形态观察结合同工酶技术等方法。王暄[13]等通过形态观察和同工酶分析，报道了中国根结线虫新纪录种——西班牙根结线虫。柳永娥[14]等通过雌虫会阴花纹观察与苹果酸脱氢酶和酯酶测定相结合的方法，鉴定了甘肃省白银市保护地蔬菜根结线虫病的病原有2种，为南方根结线虫和爪哇根结线虫，其中优势种群为南方根结线虫。但是上述方法往往会受限于虫态的发育阶段，供试线虫需要量大且需要技术人员有较高的专业水平，耗时较长。而采用雌成虫会阴花纹特征结合特异性引物PCR扩增技术的鉴定方法得到越来越多的应用。杨艳梅[15]等采用雌成虫会阴花纹形态观察及分子生物学检测（rDNA-ITS区和SCAR特异性鉴定）技术，鉴定了云南省部分烟区根结线虫种类，主要有南方根结线虫、花生根结线虫和爪哇根结线虫，其中花生根结线虫为优势种群。罗佳[2]等用该技术将重庆番茄根结线虫病的病原鉴定为南方根结线虫。

我国已报道作物根结线虫40余种，本研究仅对4种常见根结线虫进行鉴定，明确危害四十七团设施蔬菜的根结线虫为南方根结线虫，暂未发现其它根结线虫种类。关于新疆设施蔬菜根结线虫的种类和分布还需要在今后的工作中加强监测，尤其在种苗调运过程中需加强检疫，防止其它种类根结线虫的人为传播。