犊牛大肠杆菌、沙门氏菌佐剂灭活疫苗的制备与临床效果观察*

吴中艳，覃 杰

（1.第二师三十七团农业发展服务中心，新疆 且末县 841900；2.第二师畜牧兽医站）

犊牛大肠杆菌病是由大肠杆菌引起的以犊牛腹泻和败血症为主要症状的一种细菌性疾病，是牛的一种常见疫病[1]。沙门氏菌病又名副伤寒，临床上多表现为败血症和肠炎，也可使怀孕母畜发生流产。这两种病均可致使犊牛的生长发育受阻甚至死亡，给养牛业造成严重的经济损失。目前，主要采用抗生素防治牛大肠杆菌病和沙门氏菌病，然而抗生素的大量使用会产生耐药性和药物残留。疫苗防控有着很好的安全性，但大肠杆菌和沙门氏菌血清型众多，不同地区血清型差异较大，本试验从腹泻牛中分离鉴定出当地的优势血清型，制备成二联四价氢氧化铝佐剂灭活疫苗，经临床试验免疫原性和安全性均良好。

1 试验材料

1.1 病料

腹泻犊牛中分离鉴定出O78、O111血清型大肠杆菌、都柏林沙门氏菌、鼠伤寒沙门菌沙门氏菌。

1.2 主要试剂

营养琼脂、麦康凯琼脂、LB肉汤，均购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.3 试验动物

昆明系小白鼠来自石河子大学实验动物中心，实验牛来自铁门关市三〇团和三十一团牛场。

2 试验方法

2.1 大肠杆菌和沙门氏菌悬液的制备与灭活[2-3]

将4种菌株分别接种于营养琼脂培养基上，挑取培养物接种于LB肉汤培养，制取种子液。将种子液增菌并稀释细菌浓度为1014个/mL，将4种菌液按照1∶1∶1∶1比例等体积混合，向菌液中加入终浓度为0.2%甲醛溶液，灭活24 h。将菌液接种营养琼脂和麦康凯琼脂培养基检测细菌活力。将收集的灭活菌液置于离心管中，以12 000 r/min离心5 min，弃去上清液。在超净工作台将菌体用少量的生理盐水边稀释边倒入80目铜筛并过滤到灭菌瓶中，直至所有菌体都过滤到灭菌瓶中，然后加入生理盐水，最终配制成含菌量3×1010个/mL浓度的菌液。

2.2 灭活疫苗的制备

用硫酸铝和氢氧化钠配置成氢氧化铝佐剂原液，按1∶4与生理盐水混合，配置成佐剂。按菌液量的1/3加入佐剂，充分混合，制成二联四价灭活疫苗。成年牛注射剂量为6 mL/头份，犊牛减半。

2.3 灭活疫苗的质量检验

无菌检验：将灭活疫苗0.2 mL分别接种于营养琼脂和麦康凯琼脂平板上，37 ℃培养48 h观察有无细菌生长。

安全性试验：取10只昆明系小白鼠（公母各半），分别颈部皮下注射灭活疫苗0.1 mL，观察采食、精神、注射部位状况及死亡情况。选取15日龄、60日龄、200日龄和2岁健康牛各10只，分别颈部皮下注射疫苗6 mL（2岁牛12 mL），连续15 d观察试验牛注射部位、精神、采食和发病状况。

2.4 疫苗效力检验

取20只成年小白鼠随机分成2组，试验组（首免后14 d加强免疫1次）皮下注射疫苗0.1 mL/只，对照组注射生理盐水，42 d后试验组和对照组分别用分离培养的O78大肠杆菌、O111大肠杆菌、都柏林沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌混合菌液0.5 mL/只皮下注射攻毒，7 d后观察小白鼠采食、精神、存活和死亡情况，如出现死亡，对其进行细菌分离培养鉴定。

2.5 灭活疫苗免疫效果观察和攻毒试验

试验犊牛65头，分为4组，采用皮下注射方法，其中：A组15头，1日龄首免，14日龄加强免疫1次；B组15头，1日龄首免，21日龄加强免疫1次；C组15头，60日龄首免，81日龄加强免疫1次；D组为对照，20头，1日和60日龄牛各10头，注射生理盐水。

血清抗体效价检测。抗原制备：O78大肠杆菌、O111大肠杆菌、都柏林沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌各3×1010个/mL的菌液50 mL，经高压灭菌破坏其菌毛抗原后作为抗原诊断液。采用玻片凝集试验方法，取100 μL血清用生理盐水从1∶2开始做倍比稀释到1∶256，用稀释血清50 μL和50 μL抗原等体积混合，搅拌均匀，观察其凝集现象。分别于首免后7 d、14 d、21 d、42 d、180 d检测。

攻毒保护试验。将浓度为3×1010个/mL的O78大肠杆菌、O111大肠杆菌、都柏林沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌等体积混合，取6 mL分别在首免42 d后皮下注射A、B、C、D组试验牛，连续20 d观察试验牛采食、精神及发病情况。

3 结果与分析

3.1 灭活疫苗的质量检验

无菌检查结果：经甲醛灭活后，4种细菌混合悬液在营养琼脂和麦康凯琼脂平板培养均无菌落生长，说明灭活效果良好。将疫苗接种在营养琼脂和麦康凯琼脂平板上均无菌落生长，灭活效果良好。

安全性试验结果：小白鼠注射疫苗后，除2只出现一过性精神萎靡和食欲下降外，其它小白鼠注射部位、采食及精神状况均未见不良反应。所有试验牛注射部位未见红肿、化脓等异常表现，采食及精神状况正常。表明疫苗具有较高的安全性。

3.2 疫苗效力检验结果

试验组小白鼠精神、食欲正常，无死亡情况。对照组所有的小白鼠无精神、食欲不振，死亡8只，死亡率80%。

3.3 灭活疫苗的免疫保护效果

由表1可知，疫苗首免后7 d，免疫组（A、B、C组）O78大肠杆菌血清凝集抗体效价在1∶2～1∶32，首免后14 d抗体合格率在40.0%～60.0%之间，首免后21 d抗体合格率为66.6%～80.0%，二次免疫后抗体效价提高，首免后42 d抗体水平达到最高，抗体合格率100%。免疫后180 d抗体合格率86.6%～100%。而对照组血清抗体效价始终处于1∶2以下。免疫组（A、B、C组）之间抗体效价无明显差异。

表1 O78大肠杆菌凝集抗体水平测定结果

由表2可知，疫苗首免后7 d，免疫组（A、B、C组）O111大肠杆菌血清凝集抗体效价为1∶2～1∶32，首免后14 d抗体合格率在33.3%～46.6%之间，首免后21 d抗体合格率为53.3%～73.3%，二次免疫后抗体效价提高，首免后42 d抗体水平达到最高，抗体合格率100%。首免后180 d抗体合格率86.6%～100%。而对照组血清抗体效价始终处于1∶2以下。免疫组之间抗体效价无明显差异。

表2 O111大肠杆菌凝集抗体水平测定结果

由表3可知，疫苗首免后7 d，免疫组（A、B、C组）都柏林沙门氏菌血清凝集抗体效价为1∶2～1∶32，首免后14 d抗体合格率在33.3%～53.3%之间，首免后21 d抗体合格率为53.3%～80.0%，二次免疫后抗体效价提高，首免后42 d抗体水平达到最高，抗体合格率93.3%～100%。首免后180 d抗体合格率80.0%～100%。而对照组血清抗体效价始终处于1∶2以下。免疫组之间抗体效价无明显差异。

表3 都柏林沙门氏菌凝集抗体水平测定结果

由表4可见，疫苗首免后7 d，免疫组（A、B、C组）鼠伤寒沙门菌血清凝集抗体水平在1∶2～1∶32之间，首免后14 d抗体合格率为40.0%～66.6%，首免后21 d抗体合格率60.0%～80.0%，二次免疫后抗体效价提高，首免后42 d抗体水平达到最高，抗体合格率93.3%～100%。首免后180 d抗体合格率80.0%～93.3%。而对照组血清抗体效价始终处于1∶2以下。免疫组之间抗体效价无明显差异。

表4 鼠伤寒沙门菌凝集抗体水平测定结果

3.4 攻毒保护试验

免疫组牛采食和精神状况良好，存活率达到100%；对照组牛从攻毒后第2天起，陆续发病，表现为精神沉郁、无食欲和腹泻症状，从粪便中分离得到相应细菌。使用头孢哌酮与氧氟沙星治疗后痊愈。

4 讨论

大肠杆菌和沙门氏菌的血清型众多，且有明显的地域差异，使用本地区血清型菌株制备自家灭活疫苗，是预防本地该病的有效途径[2，4]。研究结果表明，以氢氧化铝为佐剂的灭活苗具有良好的安全性，对免疫牛无或较小副反应，皮下注射后能被机体很好地吸收；从免疫结果来看，本研究制备的灭活疫苗具有良好的免疫效果，免疫后42 d，93.3%以上的免疫牛抗体效价达到1∶32以上，免疫后180 d，80.0%以上的免疫牛抗体效价仍在1∶32以上；以3×1010个/mL的致病菌攻毒，免疫牛全部存活，无不良反应，表明该疫苗免疫保护性良好。

通过试验表明，应用灭活疫苗进行免疫，首免日龄为1日龄、14日龄进行二免与21日龄二免，免疫效果无差异。首免日龄为1日龄，与首免日龄为60日龄，隔14日进行二免，免疫效果无差异。采用不同免疫时间、不同免疫间隔进行免疫，犊牛都能产生良好的免疫效果。养殖户可以根据自身实际情况选择免疫时间。