哺乳动物着床前胚胎中细胞系的分化及调控机制

王涵，赵盼盼，张坤

（浙江大学动物科学学院，哺乳动物分子胚胎学实验室，杭州310058）

哺乳动物精子和卵子融合形成受精卵，意味着早期胚胎发育的开始，随后的几天会发生一系列形态学、发育生物学和分子生物学水平的动态变化。受精之后1 d左右的胚胎转录活性较低，其发育高度依赖卵母细胞中存储的母源因子（例如：mRNA、蛋白质、代谢底物等），随着2细胞末期母源mRNA逐渐降解，胚胎基因组开始激活，但是部分母源mRNA合成的蛋白质仍然可以维持到着床前后，在着床前发育过程中发挥重要作用[1]。处于2细胞阶段的2个卵裂球仍然具有全能性，所以分割其卵裂球进行单独培养，每个卵裂球均可以发育成一个完整的个体；4到8细胞的卵裂球单独分离后可以发育到着床前，但是和其他卵裂球结合在一起仍然可以分化成所有的组织和器官，说明它们仍然具有发育全能性[2]。

着床前胚胎中的第一次形态变化发生在8细胞。这一时期，细胞表面的界限开始模糊，与此同时会发生2个重要的形态学变化，即致密化（compaction）和极性化（polarization）[2-3]。到16细胞左右，胚胎已经开始出现内外之分，但是形态上仍看不出明显变化。32细胞左右，由于卵裂球增多，胚胎外观形似桑葚，所以又称之为桑椹胚。32细胞以后，由于钠/钾离子交换和渗透梯度等变化，胚胎内部开始出现腔室——腔（cavity），该阶段又被称为囊胚，胚胎在该阶段分化为2个明显的细胞系，即滋养层（trophectoderm,TE）和内细胞团（inner cell mass,ICM）[4]。随后，内细胞团又继续分化，形成外胚 层（epiblast,EPI）和 原 始 内 胚 层（primitive endoderm,PrE）。经过这一系列的分化及位置迁移，胚胎最终到达子宫，开始着床，同时也意味着胚胎着床前发育的终止[2]。

1 致密化和极性化

8细胞阶段的致密化是胚胎着床前发育阶段的第一个形态学变化。胚胎外侧属于顶端区域，内侧属于基底部区域，相邻卵裂球之间存在黏着连接（adhesion junction）。在这个阶段，内侧卵裂球连接作用增强，外侧连接作用减弱，胚胎表面的卵裂球之间的界限变得模糊，由此形成了我们肉眼所见的一个光滑饱满的球面。参与致密化和黏着连接的一个重要蛋白是上皮型钙黏蛋白（E-cadherin，由Cdh1基因编码）[5]。致密化发生前，上皮型钙黏蛋白均匀地分布在8细胞的每个卵裂球的质膜表面；致密化开始后，上皮型钙黏蛋白聚集到基底部卵裂球的细胞间连接处。敲除胚胎基因组来源的Cdh1只影响黏着连接，并不影响致密化的形成，只是将其推迟到了桑椹胚阶段，只有同时敲除胚胎基因组和母源基因组中的Cdh1才影响胚胎的致密化[6]。

细胞极性化可以通过胚胎卵裂球细胞表面的显微结构判断。8细胞胚胎还没有发生极性化之前，微绒毛均匀分布在整个细胞表面，但是细胞一旦发生致密化和极性化，微绒毛从细胞间连接区域聚集到顶端膜区域。这种非对称组织表示顶端-基底部区域与质膜区域的蛋白因子的非对称分布，胚胎形成一个无形的顶端-基底部轴。这些因子的非对称分布导致细胞分裂时子细胞在功能上的差异，最终导致细胞的不同分化命运。

埃兹蛋白（ezrin，EZR），作为最早研究与细胞极性化相关的蛋白，参与了微绒毛的形成[7]。它跟微绒毛的分布区域一样，在极性化发生之前，均匀分布在细胞表面，但是一旦EZR被磷酸化，它便从细胞连接处聚集在顶端区域，使微绒毛也在顶端区域聚集，说明EZR的磷酸化是8细胞阶段胚胎极性化发生的重要条件[7-8]。

参与极性化作用的另一个极性蛋白复合体——aPKC-PAR（apical polarity protein/partitioning defective component，顶端极性蛋白/区域缺陷组件复合物），由顶端极性蛋白PARD3（partitioning defective 3 homologue，区域性缺陷同系物3）、PARD6、PRKCz/i及基底部极性蛋白EMK1（ELKL motif kinase 1，ELKL基序激酶1）组成[9]。这些蛋白在胚胎分化过程中呈现动态分布的过程，在2细胞到早期8细胞阶段，PARD6B和EMK1大部分在细胞核、少部分在胞质中分布，PRKCz/i在4细胞中则主要分布在胞质中，一旦细胞发生极性化，PARD6B和PRKCz/i则聚集在顶端区域的膜表面，而EMK1则反过来聚集到基底部区域的膜表面[2]。除此之外，这些极性蛋白在紧密连接和囊胚腔的形成过程中也发挥着重要作用[10]。

虽然细胞极性化和致密化都发生在8细胞阶段，但这2个事件的发生是独立进行的。前文提到敲除母源和胚胎基因组的Cdh1基因后影响致密化的形成，但是胚胎仍然有极性化现象，而且研究表明，极性化的建立是依靠独立的卵裂球作用，因此也可以看成是细胞本身自发的一种作用[11]。

2 着床前胚胎中的细胞系分化

着床前在发育过程中最明显的一个形态学变化是出现囊胚腔，从而形成囊胚。囊胚腔的形成与渗透梯度有关。胚胎发育到32细胞阶段，顶端区域的Na+/H+交换器发挥作用，使Na+内流；而基底部区域，在Na+/K+ATP酶的作用下，Na+外流，形成了渗透梯度，导致水穿过滋养层进入内侧，形成我们肉眼所见的充满流动液体的腔室[12]。囊胚的外侧是一层滋养层细胞，内部包裹内细胞团细胞，标志着第一次细胞系分化完成，随后内细胞团细胞很快分化为外胚层和原始内胚层细胞，完成第二次细胞系分化。

3 内细胞团和滋养层的分化

3.1 “内-外”假说和“极性”假说

TARKOWSI等[13]在1967年提出“内-外”假说，即处于胚胎外侧的细胞分化为滋养层，处于内部的细胞则分化为内细胞团。在此研究基础上，JOHNSON等[14]于1981年又提出“极性”假说，即在8细胞阶段，处于外侧的细胞具有极性，内侧的细胞不具有极性。细胞分裂时，如果平行于顶端-基底部轴分裂，则属于对称分裂（symmetric division），2个子细胞均具有极性；如果垂直于顶端-基底部轴分裂则属于不对称分裂（asymmetric division），导致一个子细胞具有极性；另一个子细胞没有极性。具有极性的细胞聚集在胚胎外侧，分化为滋养层，而没有极性的细胞处于胚胎内侧，发育为内细胞团。

研究发现：在非极性细胞中，磷酸肌球蛋白轻链Ⅱ（phosphor-myosin light chainⅡ,pMlc2）水平升高，皮质紧张增强，导致外部的非极性细胞有向内收缩的趋势；同时，顶端区域的极性蛋白又与这种由肌球蛋白导致的紧张收缩相互拮抗，阻止具有极性的细胞向内收缩[15]。这解释了非极性或极性弱的细胞不能留在胚胎外侧的原因。

综上所述，16细胞卵裂球的相对位置受母细胞分裂方向影响，处于顶端区域的非对称分裂导致子细胞具有不同大小的顶端区域面积，而该区域的大小又产生了细胞内缩性的差异，从而导致极性细胞最终占据外侧，非极性细胞向内收缩聚集，最终形成了滋养层和内细胞团。

3.2 转录因子对细胞分化的影响

除了细胞的致密化、极性化和不对称分裂对早期胚胎的细胞分化有影响外，转录因子在胚胎分化过程中也发挥着重要作用。对滋养层中研究比较透彻的是尾型同源框转录因子2（caudal-type homeobox transcription factor 2,CDX2）。Cdx2也是其他滋养层相关基因，比如Eomes（eomesoderin，脱中胚蛋白）、Itga7（integrin 7，整合素 7）和 Cdh3（cadherin 3，钙黏蛋白3）等上游调控因子。在胚胎干细胞中过表达Cdx2可以促进滋养层的分化[2,16]，敲除Cdx2后的胚胎由于不能形成成熟的滋养层导致着床前胚胎发育停滞，同样，在胚胎干细胞中敲除Cdx2也不能形成滋养层干细胞。

内细胞团中的重要转录因子主要有Sox2（SRY-box 2）和Oct4（octamer-binding protein 4，八聚体结合蛋 白 4），又 称 POU5F1（POU domain,class 5,transcription factor 1，POU域，5类，转录因子1）和Nanog同源框（Nanog homeobox）。Sox2是内细胞团中最早开始特异表达的标记基因，从16细胞开始就逐渐在内部细胞表达[17]。OCT4从2细胞到中期囊胚均匀分布在每个卵裂球的细胞核中，到后期囊胚逐渐聚集到内细胞团区域。NANOG从8细胞阶段开始表达，与OCT4表达谱相类似，直到晚期囊胚才逐渐聚集到内细胞团中[2]。

研究发现，CDX2和OCT4、NANOG之间存在相互表达抑制的作用；敲低Cdx2后，OCT4和NANOG在滋养层异位表达；进一步的研究发现，Cdx2可以结合到Oct4和Nanog编码区的启动子区域，从而导致Oct4和Nanog的转录受到抑制[18-19]。在小鼠胚胎干细胞上的实验表明，Oct4也可以结合到Cdx2的启动子区域，导致其转录抑制[20]。值得一提的是，CDX2和NANOG、OCT4表达相互抑制的作用在晚期囊胚阶段才比较明显[17,19]。

Ctr9是PAF1/RNA聚合酶Ⅱ复合物的组分之一。我们研究发现：Ctr9的敲低会造成囊胚滋养层细胞失去贴壁生长的能力；细胞系标记分析显示，Ctr9敲低后，滋养层标记Eomes、Elf5和内细胞团标记Sox2的表达量下降，Oct4、Nanog、Gata6、Fgf4和Sox17的表达也出现异常，且胚胎中H3K36me3的信号显著下降；H3K36特异的组蛋白甲基化转移酶Setd2和另一个PAF1复合物的组分Rtf1的敲低也会引起类似于Ctr9敲低的表型[21]。这些结果说明，PAF1复合物在着床前胚胎细胞系分化过程中扮演着重要角色。

3.3 原始内胚层和外胚层的分化

内细胞团继续发育逐渐分化为原始内胚层（PrE）和外胚层（EPI），完成第二次细胞系分化。其中，原始内胚层将来发育为卵黄囊，外胚层最终发育为胎儿。NANOG和GATA6（GATA binding protein 6，GATA结合蛋白6）分别是标记外胚层和原始内胚层的转录因子[4,22]。虽然原始内胚层和外胚层在晚期囊胚阶段（E4.5）才出现表型差异，但是它们早在32细胞阶段就已经开始出现分化，主要由NANOG和GATA6的选择性表达进行调控。NANOG和GATA6从8细胞阶段开始均匀分布在各个卵裂球中（8细胞开始，NANOG和GATA6在各个卵裂球中均有表达）；但从32细胞阶段开始，NANOG和GATA6在内细胞团中的表达出现差异，选择表达NANOG的卵裂球将来分化为外胚层，选择表达GATA6的卵裂球将来则分化为原始内胚层，此时，NANOG和GATA6的表达存在相互抑制作用，形成我们所见的“椒盐分布”（“salt and pepper”expression）现象[2,23]。而到晚期囊胚阶段，GATA6逐渐聚集到原始内胚层区域，NANOG则主要在外胚层中表达。

3.4 影响早期胚胎分化的信号通路

3.4.1 Hippo通路

Hippo信号通路是影响胚胎早期分化的最重要的通路之一。通过研究小鼠胚胎中敲除Tead4的表型，人们首次发现该通路在胚胎发育中的重要作用[24]。Tead4作为Hippo通路的一员，在其缺失的胚胎中，Cdx2表达明显下降，也不能形成滋养层。Tead4在内细胞团和滋养层的细胞核中均有表达，只是在内细胞团的核内信号比滋养层的稍弱[25]。进一步的研究发现，在外侧的滋养层细胞中，Hippo通路处于未激活状态，LATS1/2（large tumor suppressor kinase 1 and 2）允许未磷酸化的Yap进入细胞核与Tead4结合，促进滋养层相关基因的表达，如Cdx2和Gata3[24,26]。而在内细胞团细胞中，Hippo通路被激活，Yap被LATS1/2激酶磷酸化，磷酸化后的YAP被阻滞在胞质中无法进入细胞核与Tead4结合，使Cdx2和Eomes等相关基因的表达受到抑制[27]。

另外，有研究发现，Tead4突变的胚胎在低氧条件下仍然可以形成滋养层[4]，说明除了Tead4以外可能存在其他调节细胞分化的机制。后来的研究也证实了这一假说，在Tead1突变的胚胎中Cdx2的表达也有所下降，在Tead1和Tead4双重突变的胚胎中Cdx2表达量的下降比Tead4单独突变更显著，说明Tead1在调节滋养层的发育中发挥着一定作用[26]。

NF2/Merlin作为Hippo通路中的另外一个组成因子，在滋养层的分化中同样起着重要作用[28]。研究表明，Nf2是LATS激酶的上游调节因子，敲除Nf2后，Yap不能转移到外侧的滋养层细胞的细胞核中，CDX2也不能在外侧细胞表达。同样，AMOT作为Hippo通路的重要成员，也发挥着类似的作用，不过在内外侧细胞的位置有些差异。在外侧滋养层细胞中，由于基底侧区域的抑制作用，AMOT主要聚集在顶端区域表达；而在内部的内细胞团中，AMOT的第176位丝氨酸（S176）被磷酸化，而S176磷酸化的AMOT可以增强与LATS激酶的联系，进而促进Yap的磷酸化，磷酸化后的Yap无法进入细胞核与Tead4结合，因此抑制了Cdx2的表达[29]。

Hippo通路除了可以调节滋养层相关基因的表达，还可以调节内细胞团中特定基因的表达，如Sox2。如果在滋养层中抑制Yap在细胞核中的表达会导致Sox2在滋养层异位表达，表明Yap在调节Sox2的表达中也发挥着重要作用[30]。

此外，研究还发现细胞间的极性化和黏着连接对Hippo通路的激活起着重要作用。上文我们提到aPKC-PAR复合物对于调控细胞的极性化有重要作用。PAR3-PAR6-aPKC促进顶端区域的建立，PAR1促进基底部区域的建立。如果破坏aPKCPAR复合物，会破坏32细胞阶段外部细胞的极性化，Hippo通路在外部细胞激活，从而导致YAP在外部细胞的胞质中表达。该结果表明：在内侧细胞中，非极性的细胞间存在黏着连接，这种连接作用可以激活Hippo通路；相反，在外侧细胞中，细胞发生极性化，同时还有aPKC-PAR复合物的抑制作用，细胞黏着作用减弱，Hippo通路被抑制[26,29]。

3.4.2 RTK通路

受体酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）属于细胞表面受体家族，它可以结合细胞外一些因子激活不同种类的通路，其中包括MAPK/ERK和PI3K等通路。RTK还有一些亚家族，比如FGFRs、EGFRs、VEGFRs和 PDGFRs[31-33]。研究发现，RTK通路还与哺乳动物胚胎发育中2次重要分化事件相关，即滋养层/内细胞团的分化和内细胞团向原始内胚层和外胚层的分离。

ERK2作为MAPK/ERK通路的效应器，在8细胞阶段的胚胎卵裂球中被检测到，随后分布到所有细胞中，若是在8细胞阶段抑制MAPK的表达，则Cdx2表达量会显著下降，从而影响滋养层的发育。

GRB2是RTK通路相关的一个衔接蛋白，在敲除Grb2的囊胚中，GATA6不表达，而NANOG的表达则占据整个内细胞团区域，而非呈现出与GATA6的“椒盐分布”现象[32]。有趣的是，在后来的研究中发现，在不同阶段抑制RTK通路所呈现的表型不同。在桑椹胚阶段抑制该通路，无论NANOG表达与否，GATA6均不表达；出现囊胚腔后抑制该通路，只有在NANOG不表达的情况下，GATA6才表达。这表明RTK通路对GATA6的起始表达有着重要作用，但其表达的维持不依赖RTK通路而只需要NANOG表达的下调。研究还发现，抑制RTK通路的野生型和GATA6突变的胚胎中NANOG表达均有上升，说明RTK不仅影响原始内胚层分化，对于维持NANOG的正常水平也有重要作用[34]。

原始内胚层和外胚层分化也存在着相互抑制的现象，FGF通路在其中起着重要的作用。在囊胚形成以后，FGFR2在3.5胚龄后特异性表达于原始内胚层，FGF4在外胚层里依赖于NANOG特异性表达，随后会到原始内胚层中发挥作用。在外胚层细胞中，高表达水平的NANOG会促进Fgf4的表达并分泌到原始内胚层细胞中，FGF4和原始内胚层的FGFR2结合，可以激活GRB2和MAPK，从而促进原始内胚层标记基因的表达，如Gata6。同时，在原始内胚层中，FGF4还可以抑制NANOG的表达来抑制细胞向外胚层分化，从而促进细胞向原始内胚层分化[32,35]。

3.4.3 Notch通路

Notch通路是作用于细胞之间，可调节细胞、组织、器官的分化和发育的信号通路，在该通路中分泌的NICD（Notchintracellular domain，Notch胞内区域）转移到细胞核中，与转录因子RBPJ（recombination signal binding protein for immunoglobulin kappa Jregion，重组信号结合蛋白免疫球蛋白卡帕J区域）结合，从而激活目标基因的表达[36-37]。研究表明，Notch和Hippo通路可以共同调节Cdx2的表达[38]。在分别敲除Tead4和Rbpj的胚胎中，发现敲除Rbpj的胚胎表型更差。抑制NICD的产生会引起CDX2的表达下降，相反，如果过表达NICD则会导致内细胞团和滋养层的不均衡分化[38]。尽管有研究表明Notch通路可以诱导Cdx2的表达，但其作用机制和作用时间尚未探究清楚。

4 展望

小鼠的早期胚胎发育是一系列动态变化的过程，需要各种信号通路、表观遗传学等方面的精确调控。本文主要阐述了小鼠胚胎着床前发育的一些基本的生物学事件和相关信号通路对早期胚胎发育和分化的影响，还有很多其他的相关通路和机制有待进一步阐述。但是目前涉及更具体的机制方面的研究还不是很透彻，包括影响早期胚胎发育的一些基因也还不明确，因此，未来需要开展大量的工作对这些基因进行深度挖掘。

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