利用电化学法结合丝素膜调控羟基磷灰石沉积及其形貌

王天云，张青，朱良均，杨明英

（浙江大学动物科学学院应用生物资源研究所，杭州310058）

羟基磷灰石（hydroxyapatite,HAp）是人体骨组织中的主要无机成分，具有良好的生物相容性、骨诱导性和骨传导性，在骨组织工程领域具有良好的应用前景。研究表明，HAp的形貌、颗粒大小、形状等对其成骨性具有很大影响。天然骨组织中的羟基磷灰石是在体内钙离子、磷酸根离子与天然胶原蛋白相互作用下形成的针状纳米颗粒[1]。如何利用有机分子和无机离子的相互作用制备出具有良好的促干细胞分化及成骨性的HAp形貌是骨组织工程领域的研究热点之一[2]。

丝素蛋白（silk fibroin,SF）是一种性能优良且容易获取的天然高分子，其内部结构由一系列小的疏水性氨基酸及亲水性大侧链氨基酸组成。这种组分和结构赋予了丝素蛋白易于降解、结构可控和良好的生物相容性等特性[3]。随着生物材料的发展，丝素蛋白已经在组织工程、肿瘤治疗和检测及纳米医学等领域得到了应用和实践。丝素蛋白本身所具有的羧基能很好地结合钙离子，进而调控HAp的形成及形貌。研究表明，丝素纤维和丝素蛋白膜在HAp矿化液中能很好地调控HAp的成核和生长，所得到的各种形貌的HAp能表现出不同的生物相容性和骨诱导活性，从而促进骨修复[3-4]。

目前，丝素纤维或丝素膜调控HAp的沉积形貌通常是在模拟体液中通过自然矿化的方式完成。该方法虽然工艺条件温和，但制备周期过长，一般需要7 d的矿化才能实现HAp完全覆盖材料表面[5]。电化学沉积HAp技术是一种利用电场从电解液中沉积粒子到导电基体上从而得到HAp涂层的方法。其简要原理是：在通电的情况下，阴极表面由于水的电解，产生氢气，导致局部pH随电流强度的增大而升高；在较高pH下，电解液中的Ca2+和H2PO4-与溶液中的OH-反应，导致溶液局部过饱和，当饱和程度达到磷酸钙盐化合物溶解度时，在阴极上即可沉积出相对应条件的磷酸钙盐涂层[6]。由于其工艺温和、非直线涂覆及可控性强等特点，因此，近年来在仿生矿化HAp涂层中广受采用，并能获得形貌各异的HAp涂层[7]。

本文拟结合丝素蛋白和电化学沉积对HAp形貌的调控能力，通过改变沉积过程中的工艺参数，以期制备出具有良好生物相容性和成骨性能的HAp形貌，为HAp和HAp/SF复合材料在骨修复中的应用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

试验仪器：1702型电子分析天平（Sartorius GMBHGottingen公司，德国）、CH8660型电磁炉（客浦公司）、MD44透析袋（8～4 kDa）、GZX-9140MBE型数显电热鼓风干燥箱（上海博迅实业有限公司）、8400s型傅里叶红外光谱仪（Shimadzu公司，日本）、SIRO型扫描电子显微镜（FEI公司，荷兰）、IVIUM电化学系统（基本型，荷兰）。

试验材料：家蚕茧，由浙江大学动物科学学院应用生物资源研究所提供；无水Na2CO3、溴化锂（LiBr）购自阿拉丁试剂（上海）有限公司；NaOH、Ca(NO3)2·4H2O、HNO3、(NH4)2HPO4、丙酮、乙醇均购自国药集团化学试剂有限公司。所用试剂均为分析纯。

图1 基底表面电化学沉积HAp涂层原理示意图Fig.1 Schematic diagram of HAp coating on basement surface by electrochemical deposition

1.2 方法

1.2.1 再生丝素蛋白溶液的制备

蚕茧脱胶处理：将1 cm2大小的茧壳放入0.01 g/mL Na2CO3溶液中煮沸30 min，重复1次后，用清水洗净并干燥得到脱胶的丝素纤维；然后将脱胶的丝素纤维按0.1 g/mL浸没于9.3 mol/L的LiBr溶液中，60℃水浴3 h，使丝素纤维完全溶解；随后经透析、浓缩得到合适浓度的再生丝素溶液，备用。

1.2.2 HAp在SF膜表面的电化学沉积

采用电化学暂态法模式和三电极体系，以SF/Ti片为阴极，铂环为阳极，电解液体系为Ca(NO3)2和NH4H2PO4，在室温下进行电化学沉积。该过程的原理如图1所示。沉积涂层经去离子水冲洗后，自然晾干，用于后续检测表征。

钛（Ti）基体预处理[8]：采用4 cm×5 cm×1 mm的钛板作为金属基体，经砂纸磨光，去离子水清洗后，置于HF和HNO3混合溶液[V(HF)∶V(HNO3)=1∶3]中酸洗10 min，再置于丙酮和乙醇混合溶液[V(丙酮)∶V(乙醇)=1∶1]中超声清洗15 min，用去离子水保存待用。

SF/Ti板复合电极的制备：在钛板电极上滴加丝素蛋白溶液，自然条件下风干后，用75%乙醇处理使其β化；将贴合了丝素膜的钛板作为阴极电极，采用电化学暂态法在SF/Ti板复合板上进行HAp的电化学沉积。

电解液的制备：配制0.042 mol/L Ca(NO3)2·4H2O和0.025 mol/L(NH4)2HPO4的混合溶液作为电解液，用0.1 mol/L NaOH溶液调节pH值。

1.3 HAp的表征

HAp形貌观察：利用SIRON型扫描电子显微镜（scanning electron microscope,SEM）表征沉积的HAp形貌。首先在电镜板上贴合导电胶，将制备好的样品黏合于导电胶上，进行喷金处理后用于SEM观察。

HAp元素组成表征：通过SEM的电子能谱分析（electron diffraction spectroscopy,EDS）检测沉积HAp的元素组成。

HAp晶相分析：采用XPert Powder型X射线衍射仪（帕纳科公司，荷兰），对基底上所沉积的HAp粉末进行物相分析。测试条件为：管电压40 kV，管电流40 mA，扫描速率5（°）/min，衍射角范围0～90 °。

HAp化学结构表征：采用傅里叶变换红外光谱仪（Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR）分析沉积HAp的化学结构。将样品与溴化钾（KBr）以质量比1∶100混合，用研钵研磨成粉后置于50℃烘箱中烘干2 h，最后压成薄片进行检测。设定仪器扫描范围为400～4 000 cm-1。

图2 沉积前后SF/Ti板表面图Fig.2 Images of SF/Ti plate surface before and after electrochemical deposition

2 结果与讨论

2.1 沉积时间对HAp形貌的影响

从图2中可以看出，在电化学沉积初期，表面有白色物质形成，而随着时间的延长，涂层明显加厚且更均匀。

图3为沉积电流密度1.5 mA/cm2、电解液pH 4.7，电化学沉积时间分别为1、5、10、20、30、35、45和60 min时所得到的HAp涂层形貌。从中可知：在沉积时间为1 min时，涂层形貌初步形成，呈块状平台，伴随有小颗粒沉积（图3A）；当沉积时间为5 min时，出现多孔平面，能观察到脊状结构以及小颗粒的球状团簇晶体（图3B）；10 min时的球状团簇晶体变多，可以看到球表面有均匀突出的针尖（图3C）；20 min时，观察到的涂层结构为多孔平面上生长着球状团簇晶体，其上的针尖开始交错，整体形似花簇花枝（图3D）；当沉积时间达到30 min时，可以看到平整多孔涂层，孔隙较为均一（图3E）；当时间延长至35 min时，涂层表面在30 min形貌基础上出现新生花簇形沉积，散落在多孔平台表面（图3F）；到45 min时，球状团簇晶体在形貌顶端聚集，趋向于形成新的多孔平面（图3G）；最后在60 min时，在电镜图中可以观察到规则花簇状沉积的突起（图3H）。这表明在不同沉积时间下，HAp在SF/Ti板表面以多层累积的方式沉积。

从上述变化中可知，当沉积时间为1 min时沉积形貌初步形成，随着时间延长至30 min时，丝素蛋白膜表面可以矿化出均匀平整的多孔结构，这种均一可控的形貌是后续促干细胞分化及成骨的理想形貌[9]。因此，1 min和30 min为研究电流密度和电解液pH对沉积形貌影响的最佳时间点。

2.2 电流密度和电解液p H值对HAp形貌的影响

为进一步探讨电解液pH与电流密度对HAp形貌的影响，观察了当沉积时间为1 min时，不同电流密度与电解液pH下涂层的电镜形貌（图4）。当沉积电流密度为1.5 mA/cm2、电解液pH为4.7时，可以观察到纳米球状涂层（图4A）。当沉积电流密度为1.5 mA/cm2、电解液pH为5.3时，涂层主要以块状沉积为主（图4B），与常规的纳米羟基磷灰石球状沉积不同。当沉积电流密度为2.5 mA/cm2、电解液pH为4.7时，所得的涂层呈现尚未完全的多孔平面形貌（图4C）。当沉积电流密度为2.5 mA/cm2、电解液pH为5.3时，所得涂层形成了花瓣堆叠形貌（图4D）。

当沉积时间为30 min时，不同沉积电流密度与电解液pH下涂层的电镜形貌如图5所示。当电流密度为1.5 mA/cm2、电解液pH为4.7时，涂层表面呈现为多孔结构，孔隙较为均一（图5A）。当电流密度为1.5 mA/cm2、电解液pH为5.3时，观察到的涂层形貌为一多孔平面，孔隙较为均一，部分区域为平滑表面（图5B）。当电流密度为2.5 mA/cm2、电解液pH为4.7时，涂层平面已经生长完全，在电镜图上可以观察到平面表面分布着大量无规则多孔（图5C）。而电流密度为2.5 mA/cm2、电解液pH为5.3时，可以观察到均匀多孔平面，且孔隙为均一的纳米孔（图5D）。

图4 沉积时间1 min时不同沉积电流密度及电解液p H下HAp的电镜图Fig.4 SEM imagesof HAp depostied for 1 min under different ampere densities and electrolyte pH

图5 沉积时间30 min时不同沉积电流密度及电解液p H下HAp的电镜图Fig.5 SEM images of HAp deposited for 30 min under different amperedensitiesand electrolytepH

2.3 沉积HAp涂层成分、晶相及化学结构的表征

通过观察不同沉积时间、电流密度和电解液pH下所沉积的HAp电镜图可以发现，当电解液pH为5.3、电流密度为2.5 mA/cm2、沉积时间为30 min时，可以得到具有理想结构的沉积涂层，此时的涂层孔隙均匀，表面平整。因此，本研究利用EDS能谱分析、X射线衍射（X-ray diffraction,XRD）分析及FTIR分析对该涂层的成分、晶相组成及化学结构进行了进一步表征。EDS能谱结果（表1）表明，在沉积的白色粉末中Ca/P约为1.8，与胡仁等[10]的结果（Ca/P为1.67）较为接近。

图6A为沉积HAp的FTIR图谱。从中可观察到，在3 000～3 600 cm-1处H2O中OH-有伸缩振动峰，在1 640 cm-1处纯HAp结合水有伸缩振动峰。研究证明，在1 400 cm-1处有碳酸根伸缩振动峰[11]，1 000～1 200 cm-1处有四面体非对称伸缩振动峰，以及500～650 cm-1处有弯曲振动峰[12]。这些吸收振动峰的存在说明本研究得到的白色粉末确实为HAp。图6B为丝素蛋白基底上利用电化学沉积所得白色沉积粉末的XRD图谱。该图谱显示了 HAp 在（100）、（002）、（210）、（211）、（130）、（222）、（213）和（304）这些晶面的特征衍射峰，但总体上XRD衍射峰较宽。结合以往的研究[13-14]，说明这些沉积的白色粉末为结晶不完全的HAp。

表1 SF膜表面沉积HAp的元素含量Table1 Element of HAp deposited on SFfilm surface

图6 SF膜表面沉积HAp的FTIR图谱（A）和XRD图谱（B）Fig.6 FTIR(A)and XRD(B)spectraof HAp deposited on SFfilm surface

3 结论

本研究以SF膜为基底，结合电化学方法于常温下成功制备了纳米HAp涂层，详细探讨了各试验参数（电流密度、沉积时间和电解液pH）对沉积HAp形貌的影响。当电解液pH为5.3、电流密度为2.5 mA/cm2、沉积时间为30 min时，可以得到孔隙尺寸均一、整体形貌平整的沉积涂层，其结晶型也与天然骨组织中的纳米HAp结晶型类似。本研究揭示了利用电化学方法在SF膜表面沉积HAp的规律，为制备不同结构和功能的HAp/SF复合材料提供了设计思路和理论参考。

参考文献(References)：

[1] 王琳婷,杨明英,朱良均,等.丝胶蛋白/羟基磷灰石复合支架材料的制备及性能研究.蚕业科学,2010,36(4):639-644.

WANG L T,YANG M Y,ZHU L J,et al.Preparation and performance of silk sericin/hydroxyapatite composite bone scaffold.Science of Sericulture,2010,36(4):639-644.(in Chinesewith English abstract)

[2] 叶伟.钛表面电化学沉积纳米羟基磷灰石涂层研究.杭州:浙江大学,2007:18-23.

YE W.Titanium surface electrochemical deposition of nanometer hydroxyapatite coating.Hangzhou:Zhejiang University,2007:18-23.(in Chinese with English abstract)

[3] 帅亚俊,王捷,张青,等.丝蛋白在生物材料领域的最新研究进展.蚕业科学,2017,43(6):889-897.

SHUAIY J,WANG J,ZHANG Q,et al.Latest advances in silk-based biomaterials.Science of Sericulture,2017,43(6):889-897.(in Chinese with English abstract)

[4] 帅亚俊,何文,闵思佳,等.仿生生物矿化在丝素蛋白生物材料中的应用.蚕业科学,2012,38(6):1118-1124.

SHUAI Y J,HE W,MIN S J,et al.Application of biomineralization in silk fibroin biomaterials.Science of Sericulture,2012,38(6):1118-1124.(in Chinese with English abstract)

[5] 冯美林,张青,朱良均,等.利用等离子体技术调控丝素纤维表面性能诱导其仿生矿化的研究.蚕业科学,2017,43(1):124-131.

FENG M L,ZHANG Q,ZHU L J,et al.Surface property regulation and biomimetic mineralization of silk fibroin fibers by air-plasma technology.Science of Sericulture,2017,43(1):124-131.(in Chinese with English abstract)

[6] 马春燕,罗传旭,李立华,等.HOPG片电化学沉积羟基磷灰石初探.功能材料,2012,43(6):744-747.

MA C Y,LUO C X,LI L H,et al.Exploration of the electrochemical deposition of hydroxyapatite on HOPG.Journal of Functional Materials,2012,43(6):744-747.(in Chinese with English abstract)

[7] 王航.钛表面功能化膜层的构建及电化学沉积钙磷涂层的研究.广州:广东工业大学,2015:31-39.

WANG H.Study of functionalization membrane modified on titanium surface and interation with calcium phosphate nucleation by electrochemical deposition.Guangzhou:Guangdong University of Technology,2015:31-39.(in Chinese with English abstract)

[8] 刘茂林.钛表面电化学法沉积掺锶羟基磷灰石涂层及其形貌控制.杭州:浙江大学,2015:21-26.

LIU M L.Electrochemical deposition and morphology control of strontium-substituted hydroxyapatite coatings on titanium surface.Hangzhou:Zhejiang University,2015:21-26.(in Chinese with English abstract)

[9] 刘冰.钛及钛合金表面生物活性磷酸盐转化膜的制备与表征.济南:山东大学,2017:60-93.

LIU B.Preparation and characterization of bioactive phosphate chemical conversion coatingson titanium and itsalloys.Jinan:Shandong University,2017:60-93.(in Chinese with English abstract)

[10]胡仁,时海燕,林理文,等.电化学沉积羟基磷灰石过程晶体生长行为.物理化学学报,2005,21(2):197-201.

HU R,SHI H Y,LIN L W,et al.The crystal growth behavior of hydroxyapatite coating on titanium substrate under electrochemical deposition conditions.Acta Physico-Chimica Sinica,2005,21(2):197-201.(in Chinese with English abstract)

[11]SHIRKHANZADEH M.Direct formation of nanophase hydroxyapatite on cathodically polarized electrodes.Journal of Materials Science:Materials in Medicine,1998,9(2):67-72.

[12]WANG X,ZHUANG J,PENG Q,et al.Liquid-solidsolution synthesis of biomedical hydroxyapatite nanorods.Advanced Materials,2006,18(15):2031-2034.

[13]ABDEL-AAL EA,DIETRICH D,STEINHAEUSERS,et al.Electrocrystallization of nanocrystallite calcium phosphate coatings on titanium substrate at different current densities.Surfaceand Coatings Technolog y,2008,202(24):5895-5900.

[14]ELIAZ N,SRIDHAR T M.Electrocrystallization of hydroxyapatite and its dependence on solution conditions.Crystal Growth&Design,2008,8(11):3965-3977.