云南地区月季灰霉病病原菌的分离鉴定

张双艳，孟静，韩洋琳，吴红芝

（云南农业大学园林园艺学院，昆明650201）

月季（Rosa hybridaL.）属于蔷薇科（Rosaceae）蔷薇属（Rosa）植物，以其品种多、花色艳、形态美、花期长等特点深受人们喜爱，有“花中皇后”的美称。月季切花居世界五大切花之首，其盆花和绿篱的应用也十分流行，同时也是多种高级食品、化妆品的重要香料原料，具有重要的经济价值。切花作为月季的主要产品形式，其采后品质直接决定了月季的观赏和经济价值。近年来，随着月季种植面积的扩大和温室大棚月季的大量增长，月季病害日益严重，成为影响月季采后品质的重要因素。其中灰霉病是月季生产中常见且危害较严重的一种真菌性病害，花、叶、茎均可发病，由于其在低温高湿条件下生存与繁殖力很强[1]，已成为月季采后最严重的病害，被称为月季切花采后的“癌症”。

灰霉病是由葡萄孢属真菌（Botrytisspp．）引起的死体营养型真菌病害，其病原菌是一种兼性寄生病菌，属于半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、暗丛梗孢科、葡萄孢属[1]。灰霉病是露地、保护地作物中常见的一种真菌性病害。当温度和湿度适宜时，寄主植物表面的分生孢子萌发长出芽管并分化发育成菌丝，通过气孔和伤口或分泌一些细胞壁降解酶穿过寄主表皮，进入寄主组织，引起组织软化、腐烂，后期在寄主表面产生大量的无性分生孢子进行再次侵染[2-3]，也可以通过产生一系列不同的毒素来降低植物抵抗感染的能力，以达到侵染的目的[4]。在恶劣的条件下，大量的菌丝体相互扭结，形成表皮比较坚硬的菌核，可抵御不利的生存环境，一旦条件适宜，便能直接产出分生孢子，恢复感染周期，在灰霉病的病害循环中起重要作用[5]。

云南是中国70%以上月季切花的生产基地，也是全球重要的月季切花生产地，该地区栽培月季的时间长、规模大、种类丰富，为月季灰霉病的发生和不同病菌的生存提供了良好的条件。从昆明花拍中心和云南地区月季种植农户处调查得知，灰霉病对月季切花采后造成严重危害，直接影响了月季切花的采后品质和价格，月季灰霉病成为花拍中心和月季种植户亟待解决的问题。但关于云南地区月季灰霉病的研究尚未见报道；因此，本研究从云南18个月季切花产区采集月季灰霉病样本，采用传统形态学观察和现代分子技术相结合的方法对病原分离物进行鉴定，以确定引起云南地区月季灰霉病的病原菌种类和特征，研究结果可为月季灰霉病的防治提供重要支撑。

1 材料与方法

1.1 病样的采集和病原菌的分离与纯化

从云南18 个月季切花生产基地采集带有典型灰霉病病斑的月季花瓣、叶或嫩茎，装在自封袋里，标上切花品种、采集日期和采集地，带回实验室，保存在4 ℃冰箱中，待分离。用浇注平板法对采集的病样进行分离、纯化[6-7]。切取病样发病部位放入5 mL 离心管中，加入2 mL 无菌水，充分振荡，然后按1×10－1、1×10－2、1×10－3、1×10－4、1×10－5、1×10－6浓度梯度稀释，取1×10－4、1×10－5、1×10－6菌液各200 μL注入灭菌培养皿中，然后倒入15～20 mL 冷却至45～50 ℃的马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar,PDA）培养基，水平摇晃均匀，每个浓度设置3个重复。将接种好的培养皿倒置于20 ℃恒温培养箱中黑暗培养，将获得的分离物多次纯化后得到目标菌株。在超净工作台上用直径6 mm的灭菌打孔器在培养3 d 的菌落边缘打取菌饼，放入装有1.8 mL 20%甘油的冻干管中，每管保存3个菌饼，于4 ℃冰箱中保存24 h 后，再放入－20 ℃冰箱中冻藏，待凝固后转移至－80 ℃冰箱中保存[8]。

1.2 病原菌的形态学鉴定

将保存的菌株在PDA 培养基上活化培养3 d后，用直径6 mm 的灭菌打孔器在菌落边缘打取菌饼，转接到新的PDA 中，每皿1 个菌饼，每个菌株3个重复，分别测量24 h和48 h菌落的直径，计算菌丝生长速度，观察菌落的形状、颜色及菌核和分生孢子的产生等，15 d 后计算菌核产量和测量菌核直径。菌丝生长速度=（48 h菌落直径－24 h菌落直径）/2。

菌株的显微特征观察采用盖玻片插片培养法[9]。将病原菌制成孢子悬浮液，用浇注平板法将菌液接种在培养皿中，然后将灭过菌的盖玻片按约45 ℃角斜插在凝固的培养基上，20 ℃黑暗培养7～10 d 后，用镊子将盖玻片取下，放置在载玻片上，置于显微镜下观察。

1.3 病原菌的分子鉴定

根据菌落形态的多样性，结合样本来源，从每个月季切花产区选择4～6个代表菌株共88个菌株进行分子生物学鉴定。将保存的代表菌株在PDA上20 ℃活化培养6～8 d后刮取菌丝，用液氮充分研磨，然后用Hipure 真菌DNA 迷你试剂盒（美基生物科技有限公司）提取DNA。对代表菌株的内部转录间隔区ITS、依赖RNA 的DNA 聚合酶Ⅱ亚基基因RPB2进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增和测序，引物合成和扩增产物测序均由昆明硕擎生物科技有限公司完成。引物序列信息见表1。

PCR 反应体系（25 µL）[12]：2×RapidTaq预混液12.5 µL，正、反向引物各1.0 µL，DNA 模板1.0 µL，ddH2O 补充至25 µL。PCR 反应程序[12]：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，55 ℃（ITS）或56 ℃（RPB2）退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，共35个循环；最后72 ℃延伸8 min。

测序结果在NCBI 网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上进行BLAST 比对，用Geneious 8.0 软件对自测序列和从GenBank 上下载的相关序列进行比对和修饰，用SequenceMatrix-Windows-1.8 软件对2 段基因序列进行拼接处理。以核盘菌属（Sclerotinia sclertiorum）和 丛 梗 孢 属（Monilinia fructicola）作为外群，通过MEGA 7.0 软件，利用邻接法进行联合系统发育树构建，自展支持率分析采用1 000次重复。

表1 引物序列信息Table1 Information of primer sequences

2 结果与分析

2.1 云南地区月季灰霉病的症状

月季灰霉病在月季生长的各个时期均可发生，云南地区每年3—4 月天气转暖和8—10 月雨季时是月季灰霉病的高发期，茎、叶、花均可发病，其中花瓣发病最为严重。嫩茎和花蕾受侵染时，病斑呈黑褐色，阻止嫩茎生长和花蕾开放，最后整个受侵部位变褐枯死。当侵害叶片时，在叶缘或叶尖处往往出现暗绿色水渍状斑块（如开水烫伤），并不断向叶内扩展直至腐烂。花瓣被侵染初期，部分花瓣出现玫红色、褐色或白色斑点（随月季品种而不同），然后斑点进一步扩大，渐渐变成水渍状或变褐皱缩、腐败（图1）。在温暖潮湿的环境下，灰色霉层即分生孢子可以完全长满受侵染部位。

2.2 病原菌的形态特征

本实验从云南昆阳、晋宁、安宁、石林、弥勒等地的18 个月季切花产区月季上采集了206 个灰霉病样，根据菌落形态特征、分生孢子梗及分生孢子形态，分离到124个灰霉病病原菌。

如图2 所示，病原菌在PDA 培养基上20 ℃恒温、黑暗培养15 d后，菌落特征表现出明显的差异，根据菌落形态特征，将供试菌株分成3种类型：菌丝型、孢子型和菌核型。菌丝型有48 个菌株，生长初期菌丝从无色到白色，放射状生长，3～5 d后可覆盖全皿，有少量气生菌丝，培养至15 d 没有分生孢子或很少有分生孢子产生，没有菌核产生。孢子型有35 个菌株，生长初期菌丝从无色到灰白色，放射状或放射状同心圆生长，3～4 d 后可长满培养皿，7～10 d时产生大量气生菌丝，同时产生大量分生孢子，以同心圆分布或覆盖全皿；分生孢子梗蓬松，单生或丛生，具横隔，多数在梗中上部任意分支，或顶端任意分支，分支末端膨大，其上着生大量分生孢子，分生孢子形态可分为近圆形、卵圆形和长瓜子型，无色至淡褐色（图3）；培养至15 d 时没有菌核产生或产生少量菌核并常被菌丝和孢子覆盖。菌核型有41 个菌株，生长初期菌丝从无色到灰白色，放射状或放射状同心圆生长，3～6 d可覆盖全皿，有少量气生菌丝产生；培养至10 d 左右开始产生大量菌核，菌核以同心轮纹状排列、沿培养皿边缘分布或散乱分布在培养皿中，其中以同心轮纹状排列的菌核通常较大；菌核以黑色居多，41 株菌核型菌株中只分离到1 株黄色菌核菌株，菌核大小（1.6～12.3）mm×（1.6～9.9）mm，每皿（32±5）个菌核；没有分生孢子或很少有分生孢子产生。

图1 月季灰霉病症状Fig.1 Symptoms of rose gray mold

图2 云南地区不同月季灰霉菌培养3、15 d的菌落特征Fig.2 Colony characteristics of different pathogenic fungi of rose gray mold cultured for 3 and 15 days in Yunnan area

2.3 病原菌的分子鉴定及系统发育分析

对88个代表菌株的ITS、RPB2基因进行扩增和测序，分别得到长度约为500 bp和1 100 bp的片段，部分扩增结果如图4 所示。在GenBank 中利用BLAST 进行同源性比对，结果表明：87 株菌株的2个基因片段与B.cinerea基因相似性均在99%以上，1 株菌株（SLJY-BLZ-2）的2 个基因片段与B.fabae相似性均在99% 以上。将测得的序列与从GenBank 上获取的其他葡萄孢属真菌进行ITS和RPB2基因序列分析，并以核盘菌属（Sclerotinia sclertiorum）和丛梗孢属（Monilinia fructicola）真菌作为外群构建联合基因系统发育树，结果显示：上述87株菌株与B.cinerea聚为一支，SLJY-BLZ-2与B.fabae聚为一支（图5），自展支持率分别是76%和85%。因此，结合病原菌的形态特征，可以确定采集到的88 个侵染云南地区切花月季的病原菌为B.cinerea和B.fabae。?

图3 云南地区月季灰霉病病原菌的显微特征Fig.3 Microscopic characteristics of rose gray mold pathogens in Yunnan area

图4 ITS、RPB2引物对云南地区月季灰霉病病原菌的PCR扩增结果Fig.4 PCR amplification results of rose gray mold pathogens in Yunnan area by ITS and RPB2 primers

3 讨论与结论

灰霉病是由葡萄孢属真菌（Botrytisspp.）引起的一类重要病害，Botrytisspp.是一类在世界范围分布的病原真菌，寄主范围广，其中B.cinerea可以侵染586 属1 400 种植物，其他种的寄主范围较窄[13]；B. fabae主要侵染蚕豆，也能侵染几种其他的豆科植物[14]，暂未见到从月季上分离到B.fabae的报道。本研究从月季切花上分离得到1株B.fabae菌株，这是从月季上分离到B.fabae的首次报道。

葡萄孢属真菌属内包含的种比较多，现在国际上广泛认可的是Henneber（t1973）分类系统，该系统将葡萄孢属真菌归纳为23 个种。病原菌的传统形态学鉴定主要依据形态特征和其对寄主的专性化，但是形态特征容易因环境的改变而变化，有些葡萄孢菌寄主范围比较广泛，并且属内种与种之间的特征比较相似[15]，单靠传统形态学的方法很难准确鉴定引起月季灰霉病的病原菌。本研究通过传统形态学手段鉴定出的B.fabae病菌在菌丝形态、孢子形态及菌落特征上与B.cinerea没有显著差异，充分证实了分子辅助鉴定的必要性。随着科学技术的发展，分子生物学鉴定方法结合传统形态学方法能更加准确地鉴定病原菌。ITS区域已被广泛地应用于真菌种类的鉴别，但因其序列较短且在种内不同菌株间高度保守，提供的信息量较少，所以并不能很好地区分菌株之间的亲缘关系[12,15-16]。STAATS等通过对葡萄孢属真菌的功能基因RPB2、HSP60和G3PDH进行序列分析发现，这些基因存在足够的变异，能够鉴定形态学上无法区分的葡萄孢属的23个种，证实葡萄孢属中的23个种在基因水平上是独立的[11]。笔者在初期分析数据时曾单独采用ITS序列构建系统发育树，结果显示，供试菌株与葡萄孢属的3 个种B.cinerea、B.fabae和B.pelargonii聚为一支，其他几个种也不能被明显区分开。因此，本研究采用ITS和RPB2基因联合分析的方法构建系统发育树，结果显示：87 个菌株与B.cinerea聚到单一的进化分支中，支持率达到76%；1 个菌株与B.fabae聚到一个分支上，支持率为85%；葡萄孢属的其他种也都位于不同的分支上，能够显著区分葡萄孢属的不同种。由此表明，采用保守的ITS序列联合特定的功能基因序列分析能更准确有效地鉴定月季灰霉病病原菌。

图5 云南地区月季灰霉病病原分离物的系统发育树Fig.5 Phylogenetic tree of gray mold pathogens isolated from roses in Yunnan area

本研究分离到的124株菌株中，经培养观察，只有1株产生黄色菌核，并且持续培养1个月后，菌核已萌发产生分生孢子但仍未变色，这与李娜[8]报道的黄色系菌株相符，这也是从月季上发现黄色灰葡萄孢菌菌核的首次报道。灰葡萄孢菌黑色菌核是由黑色素集聚形成的，ZHOU 等[17]对番茄和草莓上分离到的黄色菌核研究表明，B.cinerea菌核的黑色素形成与环境适应性密切相关。本研究从侵染月季的灰霉病病原菌中分离获得的B.cinerea黄色菌核菌株，为进一步研究B.cinerea的菌核颜色与环境适应性的关联，以及B.cinerea对环境的适应机制提供了材料。

本研究用于构建系统发育树的88 个菌株中有87 株是B.cinerea，只有1 株是B.fabae，可见引起云南月季切花灰霉病的病原菌主要是B.cinerea。然而，B. cinerea在PDA 培养基上的形态特征表现出丰富的多样性，这与国内外学者的研究一致[1,18-20]，可以分为菌丝型、孢子型和菌核型3 种类型[1]，所占比例分别是39%、28%和33%，没有明显的优势类型。张静[1]、李娜[8]、吴小瑶[20]、黄燕等[21]分别在研究湖北灰葡萄孢菌、湖北保护地番茄和草莓在葡萄孢菌、广州园艺作物灰葡萄孢菌株、灰葡萄孢蚕豆分离物的多样性时发现，供试菌株可分为菌丝型、孢子型和菌核型，其中菌核型占绝大多数。本研究结果与他们的研究结果不同，造成这种差异的原因可能与菌株的寄主有关。上述几位研究者获得的灰霉菌菌株分别是从蚕豆、番茄、草莓等不同科属的植物上分离得到的，而本研究的供试菌株都是从切花月季上分离得到的，具体原因有待进一步研究。