柑橘黑斑病菌与柚黑斑病菌对苯并咪唑类杀菌剂的抗性及其分子机制

曾一冰，蒋立强，李国华，刘蕊，李红叶*

（1.浙江大学农业与生物技术学院生物技术研究所，杭州310058；2.广东省梅州市农业科学院果树研究所，广东 梅州514071）

柑橘属于芸香科柑橘属（Citrus），是世界性重要水果之一，主要种植在热带和亚热带地区。中国是世界上第一大柑橘生产国，2016 年产量达3 764万t。在中国种植的柑橘主要包括宽皮柑橘、橙、柚、柠檬和各类杂柑（2016 年中国农业统计资料）。柑橘黑斑病（citrus black spot, CBS）也称黑星病，其病原为柑橘叶点霉菌[Phyllosticta citricarpa(McAlpine) van der Aa][1]，主要分布在非洲、澳大利亚[2]、东南亚、南美洲[3-5]和美国佛罗里达等地区。在我国，广东[6]、浙江[7]、江西[8]、福建[9]、云南、四川、重庆[10]等地区的果园内均有柑橘黑斑病发生的报道，并造成不同程度的危害。柑橘黑斑病病菌主要为害柑橘的果实[11]，在柑橘果实上产生黑星型、毒性型和黑斑型病斑[12]，导致其商品价值降低，严重时可引起果实脱落、减产。目前，欧盟与美国[3-4,13]将柑橘叶点霉菌列入禁止入境的有害生物名单，致使我国出口的柑橘多次由于检测出柑橘黑斑病菌而遭到进口国退货，造成巨大的经济损失[6]。随着我国柑橘种植规模的不断扩大，加强柑橘黑斑病的防治和促进出口已成为提升我国柑橘产业效益的途径之一。

柚黑斑病（pummelo black spot,PBS），也称柚棕褐斑病（pummelo tan spot），主要发生在柚（C.maxima）类柑橘上，其病原为亚洲柑橘叶点霉菌（Phyllosticta citriasianaWulandari, Crous Gruyter）[14]，在广东、福建和广西等重要柚产区均有不同程度的发生。由于柚黑斑病病原与柑橘黑斑病病原（P. citricarpa）的形态相似性很高，加上相关研究的缺乏，过去一直被认为是由与柑橘黑斑病同一个病原种所引起的[6,15]，直至2009年WULANDARI等[14]才将其区分开来。此后，WANG等[16]证实P.citriasiana仅能从柚类柑橘品种中分离到，由此欧盟解除了对我国进口柚果的检疫。柚黑斑病可导致田间落果而影响产量，成熟果实因果面病斑而难以鲜销，因此亟待提出合理有效的化学防治方法来控制柚黑斑病的发生。

苯并咪唑类杀菌剂最早在20世纪60年代末到70年代初面世，并逐步投入到农业生产中使用，主要品种包括1968 年面世的苯菌灵（benomyl）、1971 年面世的硫菌灵（thiophanate）和甲基硫菌灵（thiophanate-methyl）、1973 年面世的多菌灵（carbendazim）等[17]。苯并咪唑类杀菌剂是一种含有苯并咪唑分子结构的高效低毒、广谱内吸性杀菌剂，该类杀菌剂基本上能防治除卵菌引起的其他所有真菌性病害，在许多国家和地区的大田作物、果树、蔬菜等众多作物上登记使用[18-19]。苯并咪唑类杀菌剂的作用机制是药剂特异性地与病原真菌的β-微管蛋白（β-tubulin）结合，干扰微管装配，抑制细胞有丝分裂[20-21]。许多研究表明，苯并咪唑类杀菌剂抗性的产生与β-微管蛋白基因的6、198、200等位置上的氨基酸点突变有关，其中尤以198位和200位氨基酸点突变最为常见。通常，敏感菌株的β-微管蛋白基因198位氨基酸为谷氨酸（Glu），而抗性菌株则为丙氨酸（Ala）或缬氨酸（Val）或甘氨酸（Gly），该位点的点突变往往使得病原菌表现出高度抗性；敏感菌株β-微管蛋白基因200位氨基酸通常为苯丙氨酸（Phe），而抗性菌株则为酪氨酸（Tyr），该位点的点突变通常使得病原菌表现出中度抗性[22-23]。

在国外，苯并咪唑类杀菌剂被广泛登记用于柑橘黑斑病的防治[23]，而在我国尚未有杀菌剂登记用于柑橘或柚黑斑病的防治（http://www.icama.org.cn），但据笔者调研和查阅文献了解到苯并咪唑类杀菌剂——多菌灵和甲基硫菌灵早已普遍应用在柑橘真菌病害的防治上[24]。此外，我国的柑橘黑斑病种群与柚黑斑病种群的遗传多样性高[25]，自然界可能存在少量抗性菌株，这些抗性菌株在受到杀菌剂使用的选择压后群体将得以扩大，从而影响这类药剂的防治效果。POSSIEDE 等[23]发现，在连续10 年使用高剂量的苯并咪唑类杀菌剂的情况下，南非的柑橘黑斑病菌种群出现了抗性菌系，这些菌株能在含100µg/mL苯并咪唑类杀菌剂培养基上生长。因此，了解我国柑橘黑斑病菌与柚黑斑病菌种群对这类杀菌剂的抗性现状，可为我国是否继续使用该类药剂作为防控柑橘黑斑病与柚黑斑病提供依据；同时，掌握柑橘黑斑病菌种群与柚黑斑病菌种群对上述药剂的抗性机制，可为建立抗性菌株的快速分子检测方法提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株及药剂

2009—2017 年从浙江、江西、四川和重庆随机采集具有柑橘黑斑病典型症状的病叶与病果，参照CHOI 等[26]的方法分离培养并单孢纯化，分别获得23、114、32 和3 株菌株。2009—2017 年从广西宜州市、广东梅州市与福建漳州市平和县采集带有柚黑斑病菌典型症状的病叶与病果，并分离培养，单孢纯化，最后分别获得34、54和34株纯培养菌株。为保证菌株的独立性，从单果、单叶上分离的菌株只保留1 株，所有菌株于马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar,PDA）斜面培养基上4 ℃保存，备用。

98%多菌灵（carbendazim）原药（上海生农生化制品有限公司）；98%嘧菌酯（azoxystrobin）原药（江苏如东众意化工有限公司）；70%甲基硫菌灵（thiophanate-methyl）可湿性粉剂[允发化工（上海）有限公司]；99%水杨肟酸（salicyl hydroximic acid,SHAM）（美国Sigma-Aldrich公司）。

培养基为常规的PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，去离子水1 000 mL。

1.2 柑橘黑斑病菌与柚黑斑病菌抗性测定方法

1.2.1 对多菌灵的抗性测定

参考冯丹等[24]的最低抑制质量浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）方法，以不能在1.0 μg/mL 多菌灵的PDA 培养基上生长的柑橘黑斑病菌与柚黑斑病菌菌株定义为敏感菌株（carbendazimsensitive,Cab-S），以能在10.0 μg/mL多菌灵的PDA培养基上生长的柑橘黑斑病菌与柚黑斑病菌菌株定义为抗性菌株（carbendazim-resistant, Cab-R）。根据所得的Cab-R菌株与所测总菌株数的比值，计算得出Cab-R菌株的百分率，即抗性频率。根据筛选得到的抗多菌灵的柑橘黑斑病菌株数与柚黑斑病菌株数，挑选相应数量的敏感菌株数，测定以上所有挑选的菌株的有效中浓度（median effective concentration, EC50）值。抗性系数用抗性菌株EC50均值与敏感菌株EC50均值的比值来表示。抗性系数小于5，认为没有抗性，为敏感型菌株（sensitive isolates,S）；抗性系数在5～20 之间，为低抗型菌株（low-resistant isolates, RL）；抗性系数在20～100 之间，为中抗型菌株（middle-resistant isolates, RM）；抗性系数大于100，为高抗型菌株（high-resistant isolates, RH）[27]。EC50值的测定采用菌丝生长速率法[28]：取98%多菌灵原药0.01 g 溶于990µL 无菌水和10µL 11.74 mol/L浓盐酸中，制得0.01 g/mL多菌灵母液，再用无菌水稀释成梯度浓度药液，将其加入到50 ℃左右的150 mL PDA 培养基中，制成一系列不同浓度的含药培养基。其中，测定敏感菌株EC50值所用的多菌灵质量浓度梯度为0（对照组）、0.005、0.01、0.03、0.09、0.27 µg/mL；测定抗性菌株EC50值所用的多菌灵质量浓度梯度为0（对照组）、50、100、200、300、400µg/mL和0（对照组）、1、2、4、8、15µg/mL。在含有硫酸链霉素（streptomycin sulfate）的PDA 培养基上生长15 d 的柑橘黑斑病菌与柚黑斑病菌菌落的边缘打取直径为5 mm 的菌碟，接种在含上述系列浓度多菌灵的PDA培养基的中央，在25 ℃条件下12 h/12 h光暗交替培养15 d，用十字交叉法测量菌落直径。每处理重复3 次，计算菌丝生长抑制率。

1.2.2 与甲基硫菌灵的交互抗性测定

由于甲基硫菌灵与多菌灵同为苯并咪唑类杀菌剂，因此以相同质量浓度10.0 μg/mL 作为甲基硫菌灵的最低抑制质量浓度，以能在含10.0 μg/mL 甲基硫菌灵的PDA 培养基上生长的菌株视为抗性菌株。将筛选得到的相应敏感菌株与抗性菌株移入含0.1、1.0 和10.0 μg/mL 甲基硫菌灵的PDA 培养基上，观察其生长情况，每个菌株重复3次。若Cab-R菌株在10.0 μg/mL 甲基硫菌灵PDA 培养基上能生长，而Cab-S在10.0 μg/mL甲基硫菌灵PDA培养基上不能生长，则表明Cab-R与甲基硫菌灵存在交互抗性；反之亦然。

1.3 柑橘黑斑病菌与柚黑斑病菌抗性分子机制研究

1.3.1 基因组DNA 的提取

刮取在PDA 培养基上生长15 d 的柑橘黑斑病菌与柚黑斑病菌菌丝体，放入2 mL 的离心管中，加入液氮研磨，用十六烷基三甲基溴化铵（cetyl trimethyl ammonium bromide,CTAB）法提取真菌的基因组DNA，于－20 ℃条件下保存，备用。

1.3.2 柑橘黑斑病菌与柚黑斑病菌的抗性机制研究

利用浙江大学生物技术研究所李红叶教授实验室已测序完成的柑橘黑斑病菌基因组与柚黑斑病菌基因组，将近似种柑橘绿霉病菌（Penicillium digitatum）的β-微管蛋白基因（PdRUB2，GenBank 登录号：D78154）作为参考序列，进行本地比对（local blast）后得到柚黑斑病菌的β-微管蛋白基因全长。利用在线网站（http://www.ebi.ac.uk/interpro）对β-微管蛋白基因进行注释，找到第198 与200 位氨基酸的位置，取该位置上游400 bp和下游400 bp的基因序列，利用美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information,NCBI）在线设计引物网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）设计涵盖第198/200 位密码子的引物PA-bT-F/R（表1）。鉴于柚黑斑病菌与柑橘黑斑病菌的β-微管蛋白基因的相似度极高，故柚黑斑病菌β-微管蛋白基因也采用同样的引物进行扩增。引物在杭州擎科梓熙生物技术有限公司合成，并根据说明书稀释至10µmol/L 后于－20 ℃条件下保存，备用。将引物存储液稀释10 倍后用于聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增。

表1 扩增柑橘黑斑病菌β-tubulin基因部分序列的引物信息Table 1 Primer information for amplifying partial sequences of the β-tubulin gene in P.citricarpa

1.3.3β-微管蛋白基因测序

用PA-bt-F/R 引物，对筛选的抗性菌株和敏感菌株的β-微管蛋白基因进行PCR 扩增。扩增条件为：94 ℃预变性5 min；92 ℃变性45 s，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35 个循环；最后，72 ℃延伸10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，确认得到目的条带后，送至杭州擎科梓熙生物技术有限公司进行测序。测定的基因序列先用NCBI 在线翻译网页（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）翻译成氨基酸，再进行比对分析，检查抗性菌株是否发生了有意义的突变。

2 结果与分析

2.1 柑橘黑斑病菌对多菌灵的抗性及其分子机制

2.1.1 对多菌灵的抗性

分别以1.0 与10.0 μg/mL 为多菌灵抗性筛选的最低抑制质量浓度，测定了收集自浙江、江西、四川、重庆4 个地区共172 个柑橘黑斑病菌菌株对多菌灵杀菌剂的抗性。结果发现：在江西114 个菌株中出现了2 个多菌灵抗性菌株，抗性频率为1.75%；在四川32个菌株中出现了1个多菌灵抗性菌株，抗性频率为3.13%；在浙江和重庆没有出现抗性菌株（表2）。随机挑选3 株敏感的柑橘黑斑病菌株WZMG-2、JXNFMJ-231、HYMJ-204，测定其EC50值分别为0.034、0.039、0.055 μg/mL，均值为0.043 μg/mL；抗性菌株SCNM-122、NFMJ-A-3、NFMJA-6A 的EC50值 分 别 为13.043、229.346 和16.304 μg/mL，均值为86.231 μg/mL。将每一个抗性菌株EC50值与敏感菌株EC50值的均值进行比较，得到抗性菌株SCNM-122、NFMJ-A-3、NFMJ-A-6A 的抗性系数分别为303.3、5 333.6、379.2，均为高抗菌株。

表2 柑橘黑斑病菌种群对多菌灵抗性水平评价Table 2 Evaluation of carbendazim resistance of P.citricarpa

2.1.2 对多菌灵的抗性机制

用特异性引物PA-bT-F/R 扩增3 个Cab-S（HYMJ-204、WZMG-2、JXNFMJ-231）和3 个Cab-R（SCNM-122、NFMJ-A-3、NFMJ-A-6A）柑橘黑斑病菌株β-微管蛋白基因的部分序列后，通过琼脂糖凝胶电泳确认扩增的目标条带大小与预测的大小一致（图1）。对3 个Cab-S 与3 个Cab-R 的扩增条带进行测序，所得到的序列用NCBI 进行序列比对后发现，不同程度的抗性菌株发生了不同类型的点突变。其中，抗性系数较小的菌株SCNM-122、NFMJ-A-6A（分别为303.3和379.2）的β-微管蛋白基因的第200 位氨基酸发生了由苯丙氨酸（Phe）突变为酪氨酸（Tyr）的点突变（图2）。从核苷酸序列上看，这是由于第992 bp 位点的核苷酸由T 突变成了A（图3）。另一种点突变发生在第198 氨基酸位点，由谷氨酸（Glu）突变为赖氨酸（Lys），该类型抗性菌株表现出对多菌灵高度的抗性（抗性系数为5 333.6）（图2）。从基因核苷酸序列上看，这是由于β-微管蛋白基因上第985位核苷酸位点由G突变成了A（图3）。由此可见，β-微管蛋白基因第198位氨基酸位点和第200位氨基酸位点发生突变会导致菌株表现为对多菌灵杀菌剂的抗性，其中第198 位氨基酸位点突变导致菌株呈现对多菌灵更高的抗性，第200位氨基酸位点突变导致菌株对多菌灵的抗性较198位突变的要低。

图1 柑橘和柚黑斑病菌部分β-微管蛋白基因扩增结果Fig.1 Amplification result of the partial sequences of the βtubulin genes in P.citricarpa and P.citriasiana

图2 柑橘黑斑病菌β-微管蛋白基因部分氨基酸序列比对Fig.2 Alignment of partial amino acid sequences of the βtubulin gene in P.citricarpa

图3 柑橘黑斑病菌β-微管蛋白基因部分核苷酸序列比对Fig.3 Alignment of partial nucleotide sequences of the βtubulin gene in P.citricarpa

2.2 柚黑斑病菌对多菌灵的抗性及其分子机制

2.2.1 对多菌灵的抗性

分别以1.0 与10.0 μg/mL 为多菌灵抗性筛选的最低抑制质量浓度，测定了收集自广西、广东、福建3个地区的122个柚黑斑病菌菌株对多菌灵杀菌剂的敏感性。结果发现：只有在广东柚黑斑病菌群体中出现了1 个抗性菌株，抗性频率为1.85%；在广西和福建收集的菌株中均未发现多菌灵抗性菌株（表3）。随机挑选1株敏感的柚黑斑病菌株GXMY-29，测定其EC50值为0.032 μg/mL；抗性菌株GDMZ-STY-1的EC50值为439.025 μg/mL。将抗性菌株EC50值与敏感菌株EC50值的均值进行比较，得到抗性菌株GDMZ-STY-1 的抗性水平为13 719.5，说明该抗性菌株为高抗菌株。

表3 柚黑斑病菌种群对多菌灵抗性水平评价Table 3 Evaluation of carbendazim resistance of P.citriasiana

2.2.2 对多菌灵的抗性机制

用特异性引物PA-bT-F/R 扩增1 个Cab-S（GXMY-29）、1个Cab-R（GDMZ-STY-1）柚黑斑病菌株部分β-微管蛋白基因后，通过琼脂糖凝胶电泳确认扩增条带与目标条带大小一致（图1）。对这2个菌株测序后在NCBI中进行序列比对，结果发现，第198 位氨基酸位点发生了点突变，由敏感菌株的谷氨酸（Glu）突变为丙氨酸（Ala）（图4）。从基因序列上看，这是由于第986 位核苷酸位点由敏感菌株的A 变成了抗性菌株的C（图5）。抗性菌株其他位点也发生了点突变，但是都为同义突变，不改变氨基酸的种类。由此可见，β-微管蛋白基因第198 位氨基酸位点发生突变使得菌株表现为对多菌灵的高度抗性。

图4 柚黑斑病菌β-微管蛋白基因部分氨基酸序列比对Fig.4 Alignment of partial amino acid sequences of the βtubulin gene in P.citriasiana

图5 柚黑斑病菌β-微管蛋白基因部分核苷酸序列比对Fig.5 Alignment of partial nucleotide sequences of the βtubulin gene in P.citriasiana

2.3 交互抗性

在质量浓度为10.0 µg/mL 的甲基硫菌灵培养基 上，4 个Cab-R 菌 株SCNM-122、NFMJ-A-3、NFMJ-A-6A、GDMZ-STY-1均能够正常生长，4个Cab-S 菌株WZMG-2、JXNFMJ-231、HYMJ-204、GXMY-29 均不能生长。因此，认为甲基硫菌灵与多菌灵存在正交互抗性。在质量浓度为10.0µg/mL的嘧菌酯培养基上，4 株多菌灵抗性菌株（Cab-R）和4 株敏感菌株（Cab-S）都能够生长。因此，认为嘧菌酯与多菌灵无交互抗性。

3 讨论

早在20 世纪90 年代中期，苯并咪唑类杀菌剂已引入中国柑橘产区使用[24]，加上苯并咪唑类杀菌剂的作用位点单一，预期产生的抗药性风险比较高。浙江省衢州市的柑橘主产区中出现了比例较高的抗苯并咪唑类的柑橘绿霉病菌株[24]。除此之外，由于苯并咪唑类杀菌剂具有广谱的杀菌活性，在农业生产中得以广泛应用，使得农田生态系统中形成了较高的选择压力。

从本研究结果来看，在浙江、江西、四川、重庆4个地区取样的172个柑橘黑斑病菌株中，仅在江西菌株中出现了2 个多菌灵抗性菌株，抗性频率为1.75%；在四川32个菌株中出现了1个多菌灵抗性菌株，抗性频率为3.13%；浙江和重庆甚至没有出现抗性菌株。说明这4个地区绝大部分柑橘黑斑病菌株对多菌灵表现敏感。收集自广西、广东、福建地区的122 个柚黑斑病菌株中，只有在广东省54 个菌株中出现了1 个抗性菌株，抗性频率为1.85%，在广西和福建两省收集的菌株中均未发现多菌灵抗性菌株。可见，绝大部分柚黑斑病菌株对多菌灵表现敏感。因此，从总体上看，抗性菌株的比例较低。刘波等[29]报道，大棚蔬菜与草莓灰霉病菌（Botrytis cinerea）对多菌灵的抗性频率高达67%，且多为高抗。柑橘和柚黑斑病菌同属子囊菌门（Ascomycota），盘菌亚门（Pezizomycotina），座囊菌纲（Dothideomycetes），葡萄座腔菌目（Botryosphaeriales），葡萄座腔菌科（Botryosphaeriaceae），叶点霉属（Phyllosticta），其无性孢子（分生孢子）是从分生孢子器中产生，相对于灰葡萄孢菌，其周期长，繁殖量低。此外，柑橘果园的年用药次数也较葡萄、草莓和蔬菜地少，相应的选择压也小，菌株抗性频率低可能与这些因素相关。

KOENRAADT[30]在研究苹果黑星菌（Venturia inaequalis）对苯并咪唑类杀菌剂的抗性分子机制时发现，β-微管蛋白基因第198 位氨基酸位点由谷氨酸突变为丙氨酸或第200位氨基酸位点由苯丙氨酸突变为酪氨酸，均会使野生菌株获得对苯并咪唑类杀菌剂的抗性。李红霞等[31]在研究油菜菌核病菌对多菌灵的抗性分子机制时发现，野生菌株获得对苯并咪唑类杀菌剂抗性的主要原因是β-微管蛋白基因第198 位氨基酸位点由谷氨酸突变成了丙氨酸。本研究结果表明：柑橘或柚黑斑病菌β-微管蛋白基因第198位氨基酸位点由谷氨酸突变为赖氨酸或丙氨酸使得野生菌株获得了对苯并咪唑类杀菌剂的高度抗性；第200 位氨基酸由苯丙氨酸突变为酪氨酸也使得野生菌株获得了较高程度的抗性，但抗性水平较198位突变要低。这一结果与在其他植物病原真菌中的表现[21-22,30-31]一致。

本研究表明，抗多菌灵的柑橘和柚黑斑病菌抗性频率很低，基于该结果，认为在浙江、江西、四川、重庆的柑橘产区和广西、广东、福建的柚产区可以继续使用多菌灵来防治黑斑病。但值得重视的是，已发现的抗性菌株均属于高抗，连续使用苯并咪唑类杀菌剂无疑会有利抗性菌系的种群比例逐渐上升，从而导致苯并咪唑类杀菌剂的防治效果下降，甚至失效。此外，已知中国柚黑斑病种群与柑橘黑斑病种群的遗传多样性很高，变异潜力大[25]，推测极易产生克服杀菌剂抗性的突变。为了更好地控制柑橘黑斑病与柚黑斑病，延长苯并咪唑类杀菌剂在柑橘黑斑病防治上的使用期限，建议在选择柑橘黑斑病防治药剂时注意苯并咪唑类杀菌剂与其他作用机制的杀菌剂，如甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂交替使用。