不同茶树品种的茶树花黄酮苷研究

李金，陈莲芙，金恩惠，李博，屠幼英

（浙江大学农业与生物技术学院茶学系，杭州310058）

黄酮类化合物是茶叶中除儿茶素外最重要的一类化合物，主要以黄酮苷的形式存在于茶树的各个器官中。由于黄酮苷具有多种生物学活性[1-2]，且对茶叶汤色和滋味具有一定的贡献[3-5]，所以一直受到学术界的广泛关注。20世纪50年代，人们通过双向薄层层析色谱技术，首次在茶叶中检测到了黄酮苷。随着高效液相色谱-质谱（high performance liquid chromatography-mass spectrometry, HPLC-MS）、超高效液相色谱-质谱（ultra-high performance liquid chromatography-mass spectrometry, UHPLC-MS）及核磁共振波谱法（nuclear magnetic resonance spectroscopy,NMR）技术的成熟，茶叶中越来越多的黄酮类化合物被检测出来。王智聪等[6]采用UHPLC-MS测定了红茶与绿茶中15种不同的黄酮苷化合物。FANG 等[7]建立了UHPLC-DAD-MS/MS 方法，可以同时检测出茶叶中21 种不同的黄酮苷化合物。与茶叶相比，对茶树花中黄酮类化合物的研究则较少。YANG 等[8]的研究表明，在茶树花的乙醇提取物中，8种儿茶素和5种黄酮苷对茶树花抗氧化活性起到重要作用。

本文采用UHPLC-MS 方法对5 个不同茶树品种的茶树花黄酮苷进行检测，以杨梅素、槲皮素、山柰酚3 种黄酮醇作为标准品进行黄酮苷等量分析，并对不同品种茶树花中的黄酮苷进行比较，研究其在种类与含量上的差异性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验材料为梅占、水古、黄叶早、政和大白、福建水仙5个茶树品种，采花时期为全开期（种植于浙江大学茶学系实验基地）。将采摘的茶树花置于60 ℃烘箱中烘4～6 h，备用。

1.2 仪器设备

Waters 超高效液相色谱仪（Waters Corp 公司，美国），AB Triple TOF 5600 plus LC/MS 系统（AB SCIEX 公司，美国），艾科浦高端超纯水机（ACD0-0005-1，重庆颐洋企业发展有限公司），电子分析天平［AL104，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司］，恒温水浴锅，冷凝管，Welch Ultimate XP C18 柱（100 mm×2.1 mm，直径1.8 μm）。

1.3 样品的制备

准确称取1 g（0.000 1 g）茶树花样品，以1∶54的料液比加入体积分数为78%的预热乙醇，于75 ℃的水浴锅中回流提取1.86 h，而后进行抽滤，滤液冷却后将其作为供试液，每个样品均进行3次重复。

1.4 标准品的制备

准确称取5 mg 的标准品，分别溶于5 mL 甲醇中，即得质量浓度为1 mg/mL的标准品母液，分别取0.1 mL 的标准品母液于10 mL 的容量瓶中，并用甲醇定容，得到0.01 mg/mL 的黄酮混合标准品：杨梅素、槲皮素、山柰酚。

1.5 黄酮苷的UHPLC-MS 定性分析

液相条件：流动相A（99.9%超纯水，0.1%甲酸），流动相B（99.9%乙腈，0.1%甲酸）。梯度洗脱条件：0～10 min，B 相10%～18%；10～15 min，B 相18%～20%；15～20 min，B 相20%～25%；20～30 min，B 相25%～50%；进样量为10 μL，流速为0.3 mL/min，检测波长为360 nm，柱温为25 ℃。

质谱条件：m/z扫描范围为100～1 000；电离模式为正、负离子模式。正离子模式：离子源电压+5.5 kV，离子源温度600 ℃。负离子模式：离子源电压－4.5 kV，离子源温度550 ℃。空气1和空气2压力为50 Pa，氮气压力为35 Pa。最大误差：±5 mmol/L；碰撞能量范围：20～40 V。

1.6 黄酮苷的UHPLC-MS 定量分析

杨梅素苷、槲皮素苷、山柰酚苷根据相应的黄酮醇标准品进行等量分析。

1.7 数据处理与分析

采用SPSS 23.0 进行统计分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 黄酮醇标准品的检测

对3 种黄酮醇标准品分别进行UHPLC-MS 分析，所得色谱与质谱信息如表1 所示。分析可知，1号峰代表杨梅素，2 号峰代表槲皮素，3 号峰代表山柰酚。

我国林业资源丰富，但是由于人为的破坏，使得林业资源大规模的减少。人们在发展的过程中只注重经济效益，忽视了破坏森林资源所带来的生态后果。他们认为保护森林资源的做法是无关紧要的，从而做出一些加剧我国森林资源减少的行为，就会造成水土流失、生态环境破坏的问题，这样对于我国的发展是非常不利的。会对我国的森林保护工作造成非常大的阻碍。

表1 黄酮醇标准品的色谱和质谱信息Table 1 Chromatography data and mass spectrometry data of flavonol standards

2.2 茶树花样品中黄酮苷的UHPLC-MS 分析

以福建水仙品种的茶树花样品为例，采用UHPLC-MS进行测定和分析，结合质谱信息及参考相关文献[8-13]，可推断图1中的峰1～12均为黄酮苷物质，各相应峰的保留时间、质谱碎片信息及质谱鉴定结果如表2所示。

图1 茶树花中黄酮苷的UHPLC色谱图（λ=360 nm）Fig.1 UHPLC chromatogram of flavonoid glycosides of tea flowers(λ=360 nm)

如图2所示，1号化合物的分子离子峰[M-H]－为m/z=625，通过与茶树花中已检测出的黄酮苷化合物的相对分子质量进行比对，初步推断是杨梅素-3-O-芸香糖苷，当它失去1分子芸香糖基（－m/z=308）后，可形成m/z=316的杨梅素苷元，因此可以推断化合物1是杨梅素-3-O-芸香糖苷。该黄酮苷已在茶叶中被检测出来[9]，但在茶树花中却少有报道。

表2 茶树花中黄酮苷类物质的质谱信息Table 2 Mass spectrometry data of flavonoid glycosides of tea flowers

图2 各峰化合物的质谱图Fig.2 Mass spectra from peak 1 to 12

2和3号化合物的分子离子峰[M-H]－一致，均为m/z=479，初步推断为杨梅素-3-O-半乳糖苷、杨梅素-3-O-葡萄糖苷，当它们分别失去1分子半乳糖基（－m/z=162）和1 分子葡萄糖基（－m/z=162）时，可以形成m/z=316 的杨梅素苷元。已有研究证明，半乳糖苷类化合物的出峰时间相对于葡萄糖苷类化合物早[10-12]，因此可以推断化合物2是杨梅素-3-O-半乳糖苷、化合物3是杨梅素-3-O-葡萄糖苷。

4和5号化合物的分子离子峰[M-H]－均为m/z=771。碎片离子m/z=609 为丢失了1 分子半乳糖基或葡萄糖基的槲皮素-3-O-芸香糖苷片段；碎片离子m/z=463 为丢失了1 分子半乳糖基或葡萄糖基和1分子鼠李糖基（－m/z=146）的槲皮素-3-O-葡萄糖苷片段；当它们失去所有的糖基时，可形成－m/z=301的槲皮素苷元。因此，推断化合物4是槲皮素-3-O-芸香糖半乳糖苷，化合物5 是槲皮素-3-O-芸香糖葡萄糖苷。

6和9号化合物的分子离子峰[M-H]－均为m/z=755，碎片离子m/z=285 为丢失了1 分子半乳糖基或葡萄糖基和1分子芸香糖基的山柰酚苷元，推断峰6是山柰酚-3-O-芸香糖半乳糖苷，峰9是山柰酚-3-O-芸香糖葡萄糖苷。这2 种山柰酚苷已在茶树干花中被检测出，而且含量较高[13]。

7和8号化合物的分子离子峰[M-H]－均为m/z=463，碎片离子m/z=301 分别为丢失1 分子半乳糖基和1 分子葡萄糖基时的槲皮素苷元，推断化合物7为槲皮素-3-O-半乳糖苷，化合物8 为槲皮素-3-O-葡萄糖苷。

11号化合物的分子离子峰[M-H]－为m/z=593，碎片离子m/z=285 为丢失1 分子芸香糖基的山柰酚苷元，推断化合物11 为山柰酚-3-O-芸香糖苷，目前已有相关研究证实该物质存在于茶树干花中[8]。

10和12号化合物的分子离子峰[M-H]－为m/z=447，丢失1 分子半乳糖基和1 分子葡萄糖基时，可以形成m/z=285 的山柰酚苷元，推断化合物10 为山柰酚-3-O-半乳糖苷，化合物12 为山柰酚-3-O-葡萄糖苷。

表3 不同品种的茶树花黄酮苷含量Table 3 Content of flavonoid glycosides of tea flower in different tea plant cultivars mg/g

2.3 不同品种茶树花中黄酮苷组分和含量

从表3 可见，不同品种茶树花中的黄酮苷组分和含量存在较大差异。其中，福建水仙茶树花中杨梅素-3-O-葡萄糖苷的含量在5 个品种中最高，为0.436 mg/g。黄叶早茶树花中山柰酚-3-O-芸香糖半乳糖苷的含量显著高于其他几个品种，达到0.962 mg/g。梅占品种中山柰酚-3-O-芸香糖葡萄糖苷的含量最高，为1.208 mg/g，显著高于另外4 个品种。政和大白、黄叶早和水古茶树花中槲皮素-3-O-芸香糖半乳糖苷的含量显著高于其他2 个品种。在5 个茶树花品种中，福建水仙茶树花中槲皮素-3-O-芸香糖葡萄糖苷的含量最高，且显著高于政和大白、梅占和黄叶早。纵观各黄酮苷组分在不同品种茶树花中的分布情况，福建水仙品种中，除了杨梅素-3-O-葡萄糖苷和槲皮素-3-O-芸香糖葡萄糖苷的含量显著高于其他品种，有8 种黄酮苷组分在所有品种中均低于平均水平。

如表4所示，不同品种茶树花中的总杨梅素苷、总槲皮素苷、总山柰酚苷含量存在显著差异。政和大白茶树花中的总杨梅素苷含量显著低于其他品种。福建水仙茶树花中的总槲皮素苷含量最低，而黄叶早与水古茶树花中的含量则明显较高。政和大白、福建水仙和水古茶树花中总山柰酚苷的含量显著低于其他2 个品种，黄叶早中总山柰酚苷的含量最高，占到黄酮苷总量的一半以上。

由表5 可知，三糖基黄酮苷为茶树花中最主要的黄酮苷，占其黄酮苷总量的一半以上，而二糖基黄酮苷在茶树花中的含量最低。杨梅素苷主要以单糖基黄酮苷和二糖基黄酮苷的形式存在，如杨梅素-3-O-半乳糖苷和杨梅素-3-O-芸香糖苷；槲皮素苷主要以单糖基黄酮苷和三糖基黄酮苷的形式存在，如槲皮素-3-O-半乳糖苷和槲皮素-3-O-芸香糖半乳糖苷；而山柰酚苷的糖基化形式最为丰富，既有单糖基黄酮苷如山柰酚-3-O-半乳糖苷，也有二糖基黄酮苷和三糖基黄酮苷，如山柰酚-3-O-芸香糖苷和山柰酚-3-O-芸香糖葡萄糖苷。在5个不同品种的茶树花中，黄叶早中的单糖基黄酮苷显著高于其他品种，梅占和水古品种次之；二糖基黄酮苷在黄叶早茶树花中的含量最高，其次是在水古茶树花中，在政和大白茶树花中的含量最低，且黄叶早茶树花中的三糖基黄酮苷含量也显著高于其他茶树花品种。

表4 不同品种茶树花中不同苷元的黄酮苷含量Table 4 Content of flavonoid glycosides with different aglycones in tea flower of different tea plant cultivars mg/g

3 讨论

通过比较不同品种茶树花中的黄酮苷组分含量，发现在三糖基山柰酚苷中，5个品种的山柰酚-3-O-芸香糖葡萄糖苷的含量最高，其次是山柰酚-3-O-芸香糖半乳糖苷。而山柰酚-3-O-葡萄糖苷在5个品种中的含量都很低；梅占茶树花中杨梅素-3-O-半乳糖苷含量是福建水仙茶树花中的5 倍，而杨梅素-3-O-葡萄糖苷却只有福建水仙茶树花中的1/5。

此前，吴春燕等[9]用HPLC-MS测定了上述5个品种茶树叶片中黄酮苷的组分含量，发现茶叶中含量最高的为槲皮素苷，而本文结果表明，在茶树花中不同苷元黄酮苷含量最高的为山柰酚苷，槲皮素苷、杨梅素苷次之。而茶树花和叶片中的黄酮苷糖基化程度也有所不同，茶树花中黄酮苷的存在形式主要是三糖基黄酮苷，其含量占总黄酮苷含量的一半以上；而茶叶中其主要存在形式为单糖基黄酮苷与二糖基黄酮苷。茶树花中的总山柰酚苷和三糖基山柰酚的含量普遍高于它们在茶叶中的含量。相关研究表明，山柰酚苷具有重要的生物学活性，包括较强的氧化性，能抑制人白血病细胞活性，保护脑部组织细胞，缓解应激反应等[9,14-16]。

此外，茶树花中含量较高的黄酮苷为槲皮素-3-O-芸香糖半乳糖苷、槲皮素-3-O-芸香糖葡萄糖苷、山柰酚-3-O-芸香糖半乳糖苷、槲皮素-3-O-半乳糖苷、山柰酚-3-O-芸香糖葡萄糖苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷，其中山柰酚-3-O-芸香糖半乳糖苷在5 个茶树品种的茶叶里均未能检测到，而它在黄叶早茶树花中的含量接近1.000 mg/g；另外，福建水仙茶树花中山柰酚-3-O-芸香糖葡萄糖苷的含量是茶叶中的2 倍，槲皮素-3-O-芸香糖半乳糖苷和槲皮素-3-O-芸香糖葡萄糖苷在水古和福建水仙茶树花中的含量也高于茶叶中的含量，槲皮素-3-O-芸香糖半乳糖苷、槲皮素-3-O-半乳糖苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷在黄叶早茶树花中的含量高于叶片。综上表明，在不同的茶树品种中，各黄酮苷组分在其花与叶中的分布具有一定的品种差异性。

4 结论

在政和大白、福建水仙、梅占、黄叶早、水古茶树花中，检测出了12 种不同的黄酮苷，分别为杨梅素-3-O-芸香糖苷、杨梅素-3-O-半乳糖苷、杨梅素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-芸香糖半乳糖苷、槲皮素-3-O-芸香糖葡萄糖苷、山柰酚-3-O-芸香糖半乳糖苷、槲皮素-3-O-半乳糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、山柰酚-3-O-芸香糖葡萄糖苷、山柰酚-3-O-半乳糖苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、山柰酚-3-O-葡萄糖苷。

通过对不同品种茶树花中各黄酮苷组分的含量进行比较，发现黄酮苷组分的分布呈现明显的品种特异性：福建水仙茶树花中杨梅素-3-O-葡萄糖苷的含量远远高于其他品种；黄叶早中山柰酚-3-O-芸香糖半乳糖苷、槲皮素-3-O-半乳糖苷、山柰酚-3-O-半乳糖苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷的含量显著高于其他几个品种；山柰酚-3-O-芸香糖葡萄糖苷含量在所有品种的茶树花中均为最高，在梅占中更是高达1.208 mg/g。尽管不同品种茶树花的黄酮苷含量具有一定的差异性，但不同苷元的黄酮苷含量均表现为杨梅素苷＜槲皮素苷＜山柰酚苷，并且以三糖基黄酮苷为主。