贵州分布的华南湍蛙形态、系统发育与分类

肖宁，罗庆华，邓怀庆，周俊，罗涛

（1.贵阳护理职业学院，贵阳550081；2.贵州师范大学生命科学学院，贵阳550001；3.贵州师范大学喀斯特研究院，贵阳550001）

蛙科（Ranidae）湍蛙属（AmolopsCope, 1865）[1]目前包括57 种，其分布区西迄喜马拉雅山南麓，东至中国沿海丘陵，北至秦岭淮河一线，南达马来半岛，属于典型的东洋界物种[2]。其中，分布于中国的32 个物种被划分至6 个种组[3-11]，并认为华南湍蛙种组是单系群，包括来自中国东南部及印度半岛中部和北部的6 个物种[3,8,10-11]：1）分布于广东西南部的云开湍蛙（Amolops yunkaiensisLyu,Wang, Liu, Zeng and Wang, 2018）；2）分布于广东深圳的白刺湍蛙（Amolops albispinusSung, Wang,and Wang, 2016）；3）分布于福建、浙江、安徽和江西的武夷湍蛙（Amolops wuyiensisLiu and Hu,1975）；4）分布于中国南部的四川、重庆、云南、贵州、湖北、湖南、江西、福建、广东和广西，甚至分布在印度半岛北部和中部的华南湍蛙（Amolops rickettiBoulenger, 1899）；5）分布于广东南昆山和石门台自然保护区、广西龙胜都庞岭、湖南阳明山和衡山的中华湍蛙（Amolops sinensisLyu, Wang,and Wang, 2019）；6）分布于广东中山市、古兜山、上川岛、鹅凰嶂、大雾岭等地区的逸仙湍蛙（Amolops yatseniLyu, Wang, and Wang, 2019）。华南湍蛙种组一直被认为只包括具白色婚刺且无声囊的华南湍蛙和具黑色婚刺且有声囊的武夷湍蛙，而云开湍蛙、白刺湍蛙、中华湍蛙及逸仙湍蛙的发现和描述，表明了在华南湍蛙种组中具有较高的隐蔽种多样性[8,10]。

贵州地处中国西南，已报道的湍蛙属物种有四川湍蛙种组的崇安湍蛙、水城湍蛙[12]和华南湍蛙种组的华南湍蛙3 种，其中华南湍蛙分布于贵州东部各市县，崇安湍蛙仅分布于雷山县和梵净山国家级自然保护区[13]。在华南湍蛙种组的6 个成员中，除具有黑色婚刺、有声囊的武夷湍蛙与华南湍蛙易于区分外，其余5 种由于都具有浅色或白色婚刺而长期被当作华南湍蛙记录。2016—2018年，在贵州省进行全国第2 次野生动物调查期间，研究人员采集了一批湍蛙属标本，这些标本最初被记录为华南湍蛙[3,13-14]。然而，笔者通过形态学检查表明，这些标本与华南湍蛙有着可以明显区分的形态学特征；基于线粒体16S rRNA、COI基因序列重建的系统发育分析表明，这些标本与华南湍蛙种组内的中华湍蛙共同聚为一进化支，进一步很好地支持了形态学研究的结论。因此，建议将伍律等[13]原记录地区分布的华南湍蛙修订为中华湍蛙，进而将贵州东部地区分布的华南湍蛙修订为中华湍蛙。

1 材料与方法

1.1 材料

共收集了14个湍蛙肌肉样本进行分子系统学分析，其中：2个来自贵州省黄平县朱家山县级自然保护区（107°39′31.70″E，26°54′19.66″N，海拔869 m），2个来自贵州省江口县梵净山国家级自然保护区（108°45′57.83″E，27°50′12.34″N，海拔604 m），1个来自贵州丹寨县排洞镇（108°07′47.13″E，26°11′42.11″N，海拔1 397 m），1个来自贵州省雷山县雷公山国家级自然保护区（108°17′20.15″E，26°26′19.81″N，海拔868 m），5个来自贵州省麻江县龙山乡（107°44′29.10″E，26°25′10.22″N，海拔739 m），2个来自贵州省习水亚热带常绿阔叶林国家级自然保护区（106°04′12.91″E，28°24′01.66″N，海拔1 156 m)，1个来自贵州省绥阳县宽阔水国家级自然保护区（107°04′24.82″E，28°09′34.96″N，海拔846 m）。样品采取安乐处死[《实验动物 福利伦理审查指南》（GB/T 35892—2018）]后，保存在95%乙醇中并置于－40 ℃冰箱中储存，所有样品保存于贵州师范大学生命科学学院动物生态学标本室（GZNU）。这些样品的详细信息如表1所示。

1.2 形态学数据测量

依据相关测量标准[3,11]，使用游标卡尺（Serial No.14133868，德国）对所采集标本的14个形态特征进行测量（精确到0.01 mm），包括体长（snout-vent length, SVL）、头长（head length, HDL）、头宽（head width, HDW）、吻长（snout length, SNT）、鼻间距（internasal distance, IND）、眼 间 距（interorbital distance, IOD）、鼓膜到眼后角距离（tympanum-eye distance, TED）、眼径（eye diameter, ED）、鼓膜径（tympanum diameter,TD）、手长（hand length,HND）、前臂及手长（length of lower arm and hand,LAL）、足长（foot length,FTL）、胫长（tibial length,TIB）、后肢全长（hindlimb length or leg length,HLL）。

表1 本研究中使用的所有样本的采集地点、标本凭证和基因登录号Table 1 Locality,voucher and GenBank accession No.for all samples used in this study

续表1 Continuation of Table 1

1.3 DNA 提取、扩增和测序

使用DNA 提取试剂盒[购自天根生物技术（北京）有限公司]，从样本腿部肌肉组织中提取基因组DNA。选择线粒体的16S rRNA和COI基因作为分子标记，扩增引物和条件参考LYU等[11]的方法。聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）在20 μL反应体系中进行，反应条件如下：95 ℃预变性4 min；94 ℃变性40 s，53 ℃（16S rRNA）或48 ℃（COI）退火40 s，72 ℃延伸1 min，35 个循环；最后72 ℃延伸10 min。将扩增产物置于4 ℃条件下保存，并由成都擎科梓熙生物技术有限公司采用双向测序技术进行测序。

1.4 系统发育分析

在MEGA 7.0[14]中通过MUSLE 算法与默认参数对DNA 序列进行多重序列比对。将525 bp 的COI和1 039 bp的16S rRNA连接成1 564 bp的序列数据集，并进一步基于每个基因分成2 个区。最适模型基于贝叶斯信息准则（Bayesian information criterion,BIC）在PartitionFinder 2[15]中进行分区模型选择（COI基因片段的最适分区模型为GTR+G，16S rRNA 的 最适分区模型为HKY+G）。 在MrBayes 3.2[16]中使用贝叶斯法（Bayesian inference,BI）和在IQ-TREE[17]中使用最大似然法（maximum likelihood method,MLM）进行系统发育分析。在BI分析中独立运行2次，每次运行2×106代，每1 000代进行一次采样，最初25%的样本树作为老化被舍弃。在MLM 分析中，在IQ-TREE 中运行1 000 次自举重复抽样分析，使用得到的一致树来表示所分析类群的进化历史。本研究中分别使用贝叶斯后验概率（Bayesian posterior probabilities, BPP）和自举支持值（bootstrap supports, BS）来表示使用贝叶斯法和最大似然法所构建系统发育树节点的支持率。在MEGA 7.0中计算中华湍蛙（贵州样本）与湍蛙属其他物种之间的遗传距离（p-distance）。

2 结果

2.1 贵州分布的华南湍蛙的系统发育分析

系统发育树强烈支持华南湍蛙种组（Amolops rickettigroup）是一个单系群，可以进一步划分得到6 个良好支持的且具有显著差异的进化支（图1）。该种组的6 个已知物种分别形成一支，即武夷湍蛙、华南湍蛙、云开湍蛙、白刺湍蛙、中华湍蛙和逸仙湍蛙，其中武夷湍蛙成了该种组的原始进化支。贵州分布的华南湍蛙与来自模式产地广东石门台分布的中华湍蛙聚为一个进化支，其遗传距离为0.74%～1.30%，与模式产地福建武夷山分布的华南湍蛙的遗传距离为6.82%～6.96%。其中，来自贵州省黄平县朱家山县级自然保护区、江口县梵净山国家级自然保护区、丹寨县排洞镇、雷山县雷公山国家级自然保护区及麻江县龙山乡的样品与中华湍蛙模式产地（广东石门台）序列聚成一个进化亚支（进化支a），且具有高度支持的节点支持率（BPP=1.00，BS=100）和小的遗传距离（p-distance为0～0.74%）；来自贵州习水亚热带常绿阔叶林国家级自然保护区和绥阳县宽阔水国家级自然保护区的湍蛙单独聚为一进化亚支（进化支b），且与中华湍蛙（进化支a）及其他贵州样品形成姐妹群关系，具有高度支持的节点支持率（BPP=1.00，BS=100）和一定的遗传距离（p-distance 为1.14%～1.30%）（表2）。

图1 贝叶斯和最大似然法推断的系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree constructed by Bayesian inference and maximum likelihood method

在形态学上，来自贵州北部（习水、宽阔水）、中部（黄平、麻江）、东部（江口）、东南部（雷公山、丹寨）聚集成进化支Ⅵ的标本可以通过在肩部隆起的一条纵向皮肤褶或通过具有米黄色的婚刺、背面有瘰粒、腹面光滑、第三和第四指具指基下瘤等特征检索为中华湍蛙。因此，来自贵州的华南湍蛙样本应该是中华湍蛙，应将来自贵州湍蛙属样本（以往记录为华南湍蛙）分类修订为中华湍蛙（Amolops sinensisLyu,Wang,and Wang,2019）。

2.2 形态描述

依据贵州省习水亚热带常绿阔叶林国家级自然保护区2♂3♀、麻江县龙山乡1♂3♀、雷山县雷公山国家级自然保护区2♂2♀、施秉县云台山世界自然遗产地3♂3♀、绥阳县宽阔水国家级自然保护区1♂5♀、赤水桫椤国家级自然保护区2♀、黄平县朱家山县级自然保护区3♂4♀、道真县大沙河国家级自然保护区2♂3♀、江口县梵净山国家级自然保护区11♂10♀共计60个标本的形态（表3，图2）进行描述。

体型较大，雄性体长41.76～60.74 mm（49.59 mm±5.03 mm），雌性体长44.96～60.26 mm（51.67 mm±4.32 mm），雄性头宽略大于头长（HDW/HDL=1.00±0.06），雌性头宽略小于头长（HDW/HDL=0.98±0.06）；吻短且钝圆，突出于下唇；有明显的吻棱，鼻孔后下方颊部稍凹陷；眼较大而凸起；鼻孔位于吻、眼之间，略近于吻端，开口于外侧。鼓膜较小，位于眼后、口角的背面，雄性鼓膜到眼后角的距离大于鼓膜径（TED/TD=1.72±0.41），雌性鼓膜到眼后角的距离小于鼓膜径（TED/TD=0.46±0.11），鼻间距大于眼间距；颞褶显著，自眼后角经鼓膜上方达肩部；犁骨齿位于内鼻孔之间，舌心形，舌后端有较深的缺刻。

表2 本研究中湍蛙属物种之间的遗传距离Table 2 p-distances among the species of the genus Amolops in this study %

前肢较长（雄性HND/SVL=0.28±0.02，雌 性HND/SVL=0.26±0.02），指长顺序为Ⅰ＜Ⅱ＜Ⅳ＜Ⅲ，指末端膨大呈吸盘状，吸盘的相对宽度顺序为Ⅰ＜Ⅱ＜Ⅲ=Ⅳ；指端具边缘沟，其背面有横凹痕，关节下瘤明显，呈圆形或椭圆形，第Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ均具有指基下瘤（有的个体第Ⅱ指基下瘤不明显）；掌突2 个，位于第Ⅲ指基部和掌心，大而扁平，内掌突细长而突出，外掌突小而椭圆，指间无蹼和缘膜。后肢较长（雄性TIB/SVL=0.55±0.04，雌性TIB/SVL=0.52±0.05），贴体前伸时胫跗关节达眼前角；趾长顺序为Ⅰ＜Ⅱ＜Ⅲ=V＜Ⅳ；趾末端膨大呈吸盘状，趾端具边缘沟，其背面有横凹痕；关节下瘤明显，呈椭圆形，内蹠突呈长圆形，外蹠突无；趾间全蹼，第Ⅰ、Ⅴ趾游离侧以缘膜达趾端；当后肢与身体呈直角时，左右跟部刚好相遇。

生活时背面分布有黄绿色和褐色相间的斑纹，背部皮肤粗糙，整个背面散有细小的疣粒，体侧疣粒大而多。口角后端有1～2个略带乳黄色的颌腺；雄蛙上颌缘及鼓膜周围密布米黄色的婚刺，颊部、吻部及下唇的锥形刺较小；侧面粗糙，密布凸起的颗粒状疣粒；四肢背面粗糙，有深色横纹，股部2～3条，密布有颗粒状疣粒；两眼之间有一米黄色的白点；自吻端沿吻棱经眼眶背缘及鼓膜到肩部有一隆起的纵向皮肤褶，其上分布有米黄色的婚刺；咽部、胸部和腹部乳白色，同时存在深灰色的斑纹；四肢腹面粉红色；股部腹面有乳白色斑点；肛门附近分布有黄色或橄榄褐色疣粒（图2）。

第二性征：雌性（SVL=51.67 mm±4.32 mm）体型略大于雄性（SVL=49.59 mm±5.03 mm），雄性第一指内侧缘有米黄色或乳白色婚刺，其上密布锥状疣、无声囊及雄性线。

多分布在海拔800～1 400 m 的山溪急流内或溪流附近的石块上，多见于黄昏或夜晚活动，于5月在梵净山地区看见其抱对现象，推测其繁殖季节在5—6月。

表3 贵州分布的中华湍蛙的形态量度Table 3 Measurements of the type series of A.sinensis from Guizhou Province mm

图2 中华湍蛙成体Fig.2 Adult of A.sinensis

3 讨论

华南湍蛙（A.ricketti）最初是依据福建挂墩的2个标本[18]描述的，随后被记录在从中国南部到印度半岛北部和中部的广大区域[2-3,19-20]。我国分布的华南湍蛙种组一直被认为只包括2 个物种：具白色婚刺且无声囊的华南湍蛙和具黑色婚刺且有声囊的武夷湍蛙[3]。近年来，随着野外考察和研究的不断深入，发现该种组不仅仅是由华南湍蛙和武夷湍蛙所组成，而且还包含由武夷湍蛙、华南湍蛙、白刺湍蛙、云开湍蛙、逸仙湍蛙和中华湍蛙所组成的一个单系群[8,10-11]，其中当前记录的华南湍蛙可能是由多个物种组成的复合体[11]。除具黑色婚刺且有声囊的武夷湍蛙易与华南湍蛙区分外，其余的4 种由于都具浅色婚刺、无声囊，并且与华南湍蛙在外部形态上具有极高的相似性，其分布区域长期被认为是华南湍蛙的分布区[3]，其中就包括贵州分布的华南湍蛙[12]。以往对贵州地区两栖动物的资源利用、保护区建设、区系组成分析及地理区划、生物多样性保护的研究一直沿用华南湍蛙这一种名[21-24]。在本研究中，通过形态学结合线粒体基因联合分析表明：来自贵州北部（习水、宽阔水）、中部（黄平、麻江）、东部（江口）、东南部（雷公山、丹寨）分布的华南湍蛙与中华湍蛙模式产地的样本聚为进化支Ⅵ，具有高度支持的节点支持率（BS=100，BPP=1.00）和小的遗传距离（p-distance 为0.74%～1.30%）。因此，以上地区原记录的华南湍蛙应修订为中华湍蛙，虽然在以往的研究中对贵州梵净山地区的华南湍蛙进行了线粒体16S rRNA分析[24]，支持了梵净山地区分布的华南湍蛙种群的物种有效性，但是在进行系统发育分析时使用的华南湍蛙序列来自于华南湍蛙非模式产地的广西龙胜地区，而LYU等[11]结合华南湍蛙模式产地的样品认为广西东北部（包括龙胜地区）分布的华南湍蛙应该记录为中华湍蛙，并指出需要进一步确定中华湍蛙的准确分布区域。综合以往记录[13]，在本研究中所使用的样品涵盖了过去所记录分布地区的华南湍蛙，结合本研究结果，进而可以将贵州地区分布的华南湍蛙修订为中华湍蛙。

贵州地处我国西南地区，为亚热带湿润季风气候，境内地形复杂，河流密布且支系众多。乌江由西向东横跨贵州中部，苗岭为珠江水系和长江水系的分水岭[25]。本研究中，贵州地理种群样品与中华湍蛙聚为进化支Ⅵ，来自乌江以北（习水、宽阔水）、乌江以南（黄平、麻江、丹寨、雷公山）和以西（江口）的地理种群在进化支Ⅵ中可以分为a 和b 2 个进化亚支，并具有一定的遗传距离（p-distance为1.14%），这表明乌江的形成可能对贵州东部地区两侧分布的中华湍蛙地理种群的分化有一定的地理阻隔作用。

中国西南地区一直被认为是物种多样性最高的热点地区。近年来，从贵州地区描述了一些脊椎动物新种，如鱼类[26-31]、两栖爬行动物[12,32-42]和兽类[43-44]。对这些新物种的描述表明，贵州地区的物种多样性可能被高度低估。因此，迫切需要进行全面和详细的调查，以阐明该地区的生物多样性状况，特别是对环境变化敏感的两栖爬行动物。