蜂王浆主蛋白对围绝经期小鼠生殖功能的保护作用

刘欣，陈勇，沈立荣

（浙江大学生物系统工程与食品科学学院，馥莉食品科学研究院，浙江省农产品加工技术研究重点实验室，杭州310058）

围绝经期俗称“更年期”，是女性由生育期过渡到老年期的重要的生理变化阶段。围绝经期综合征（perimenopause syndrome,PMS）是女性在绝经前后因卵巢功能衰退、体内雌激素水平剧烈下降而引发的一系列以植物神经系统功能紊乱为主的症候群[1]。围绝经期综合征往往伴随潮热出汗、心慌气短、疲惫乏力、健忘、失眠焦躁等体征[2]，还可能会有明显的心理障碍，同时，患骨质疏松、心血管疾病和老年痴呆等慢性疾病的可能性也会增加，严重影响女性的身心健康和生活质量。随着我国人口老龄化程度不断加深，进入围绝经期的女性人数呈现上升的趋势，80%以上的妇女在此期间会表现出明显的不适症状，而其中10%～30%的妇女会出现严重症状[3]。因此，防治围绝经期综合征对改善女性的身心健康具有重要意义。

在临床医学中，通常采用激素替代疗法（hormone replacement therapy, HRT）来提高女性体内雌激素的水平，从而缓解围绝经期综合征。HRT主要通过补充外源激素来弥补原机体激素分泌的不足，以改善围绝经期妇女内分泌状况，延缓衰老[4]。虽然HRT 认可度较高，但其不良反应不容忽视[5]。有研究报道称，HRT 可能会增加乳腺癌和卵巢癌[6-7]等妇科肿瘤的发病风险，因而在临床应用中受到一定的限制。因此，研究和开发更加安全有效的、具有雌激素效应的天然替代品很有必要。

蜂王浆是蜜蜂（Apis mellifera）中哺育工蜂咽下腺、上颚腺和脑后腺等分泌的供蜂王和3 日龄内的工蜂幼虫食用的乳白色或淡黄色浆状物质[8]，作为纯天然的保健品，它具有丰富的营养成分和生物活性。国内外很多研究已表明，蜂王浆具有抗疲劳[9]、抗菌[10]、抗炎[11]、改善糖尿病症状[12]、抗衰老[13]、抗氧化[14]、免疫调节[15]等诸多功效。蜂王浆干物质中王浆蛋白约占50%，王浆蛋白分为水溶性蛋白和非水溶性蛋白，其中82%～90%的水溶性蛋白属于主蛋白（major royal jelly proteins, MRJPs）[16]。日本学者KAMAKURA研究证实，占MRJPs近50%的MRJP1是决定雌性蜜蜂幼虫发育成为蜂王的关键因素[17]。但因王浆蛋白和王浆冻干粉在常温下容易降解，需要在-18 ℃条件下保存，为克服这一缺陷，近年来本实验室研发了采用超滤和冻干工艺分离制备MRJPs冻干粉的方法[18]。MRJPs冻干粉具有性质稳定、不需要超低温冷冻保存的优点[19]。我们经相关实验研究证实了MRJPs的主要生物活性，如对果蝇具有抗衰老作用[20]，可增强衰老大鼠的记忆力[21]，并可部分替代胎牛血清培养人体和昆虫细胞[22]等。有关蜂王浆的类雌激素活性研究[23]日益受到关注，但关于蜂王浆中具体活性成分对女性生殖内分泌的调节作用还未见报道。为此，我们从激素分泌水平和形态学角度来评估蜂王浆中的活性蛋白MRJPs对自然衰老的围绝经期雌性小鼠生殖功能的影响，探索其对围绝经期综合征的作用机制，以期为MRJPs 作为功能食品应用于女性围绝经期综合征的预防和改善提供相关的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

11～13 月龄健康雌性ICR 小鼠50 只，清洁级，体质量（42±4）g；5月龄青年小鼠10只，体质量（33±1）g，由浙江大学实验动物中心提供。按照每笼5只饲养于浙江大学实验动物中心，基础饲料为不含MRJPs的普通标准饲料，自由采食和饮水。动物实验均征得浙江大学实验动物伦理委员会同意（ZJU20190004）。

1.1.2 主要试剂

蜂王浆主蛋白冻干粉由本实验室与杭州碧于天保健食品有限公司合作提供。MRJPs 的制备方法：将新鲜的蜂王浆用磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline,PBS）溶解，并用超滤装置过滤（该装置由2种截留分子质量的滤膜组成，其中：分子质量为1×105的滤膜用于去除大分子杂质，而分子质量为4.9×104的滤膜用于留住MRJPs）。超滤得到的蛋白质浓缩液经过真空冷冻干燥后得到冻干粉，于-80 ℃低温冰箱中保存[19]。

酪蛋白（美国Sigma 公司）；雌二醇（estradiol,E2）、孕酮（progesterone, P）、促卵泡生成素（folliclestimulating hormone, FSH）和促黄体生成素（luteinizing hormone,LH）放射免疫试剂盒（北京北方生物科技研究所）；Trizol 试剂、反转录荧光定量聚合酶链式反应试剂盒（日本TaKaRa 公司）；其他均为国产分析纯试剂。

1.1.3 仪器

ABI System ViiATM7 型聚合酶链式反应仪（美国赛默飞世尔科技公司）；SW-CJ-1FD 型超净工作台（江苏省苏州安泰空气技术有限公司）；NanoDrop 1000分光光度计、BS124S型电子天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；5415R 型冷冻离心机（艾本德中国公司）；超低温冰箱（日本松下公司）；HM355型轮转石蜡切片机（德国Micro公司）；E100型摄像显微镜（日本尼康公司）。

1.2 方法

1.2.1 围绝经期小鼠模型的构建

本实验采用自然衰老的雌性小鼠作为围绝经期模型。选取11～13月龄的雌性ICR小鼠，适应性喂养1 周，然后进行阴道上皮细胞角化试验。具体操作为：左手背位固定小鼠，右手持吸管，吸管内预先吸入0.1～0.2 mL 的生理盐水。将吸管缓慢轻轻地插入小鼠的阴道内，反复抽吸2～3 次，然后将抽取的吸液滴于提前备好的载玻片上。滴加95%的乙醇溶液，干后用1%的亚甲蓝染液染色10 min，用水冲洗掉多余的染液，风干后将载玻片置于光学显微镜下进行细胞学检查，连续观察15 d。由于小鼠的正常动情周期一般为4～5 d，分为动情前期、动情期、动情后期和动情间期[24]，因此，将阴道细胞涂片呈现动情周期紊乱、动情间期延长的小鼠作为围绝经期模型。

1.2.2 分组与给药

将造模成功的围绝经期模型雌性小鼠随机分为5 组（每组10 只）：老年模型组、MRJPs 低剂量组（125 mg/kg MRJPs，M125）、MRJPs 中剂量组（250 mg/kg MRJPs，M250）、MRJPs 高剂量组（500 mg/kg MRJPs，M500）和阳性对照组（125 mg/kg 酪蛋白）；另选10只5月龄左右的、阴道细胞学检查表现出规律的4～5 d动情周期，且周期的各个阶段都符合正常规律的雌性小鼠作为青年对照组。老年模型组和青年对照组均给予生理盐水。每日灌胃1 次，连续灌胃7周。在此期间，每日观察并记录小鼠活动、外观、粪便等情况。

1.2.3 体质量测定

从实验开始，每7 d 用电子天平称量各组小鼠的体质量并记录，每次称量均选择早晨同时间段进行，至实验结束。

1.2.4 子宫指数和卵巢指数测定

末次灌胃24 h 后，称量小鼠体质量，并统一于动情间期进行静脉注射麻醉，脱颈处死，然后在低温下迅速解剖，分离子宫和卵巢，剔除组织黏附的脂肪和筋膜，经生理盐水冲洗、滤纸吸干后用电子天平称量子宫和卵巢质量。最后将左侧部分于液氮中速冻，再转入-80 ℃冰箱中低温保存，右侧部分固定于10%的多聚甲醛中。子宫指数和卵巢指数计算公式如下。

子宫指数/（mg/g）=子宫湿质量/mg÷体质量/g；

卵巢指数/（mg/g）=卵巢湿质量/mg÷体质量/g。

1.2.5 血清激素测定

将小鼠麻醉后，采用摘除眼球的方式采集血样，并于4 ℃条件下孵育2 h，然后以3 000 r/min 离心10 min，从全血中分离得到血清，置于-20 ℃低温冰箱中保存。血清激素含量的测定严格按照放射免疫试剂盒说明书实验操作进行。所测血清激素包括雌二醇（E2）、孕酮（P）、促卵泡生成素（FSH）和促黄体生成素（LH）。

对末次灌胃24 h 后取出的子宫分成左右2 段，靠近右侧卵巢部分经10%多聚甲醛固定后，制成石蜡切片，进行苏木精-伊红（hematoxylin-eosin,HE）染色，然后在光学显微镜下用测微尺测量子宫内膜的平均厚度。

1.2.7 卵巢激素受体基因mRNA 的表达检测

采用Trizol 法提取卵巢和子宫组织的总RNA，然后参照反转录试剂盒说明书（日本TaKaRa公司）将总RNA 样品反转录成cDNA 模板。聚合酶链式反应扩增条件：95 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min。引物由武汉赛维尔生物科技有限公司合成，引物序列信息见表1。

表1 引物序列信息Table 1 Information of primer sequences

1.2.8 组织形态学观察

将固定在10%多聚甲醛中的小鼠卵巢和子宫用石蜡包埋，切片，取最大纵切面，进行HE染色，然后在光学显微镜下观察卵巢和子宫的组织形态。

1.2.9 数据处理与统计分析

在长期不对称负荷和突然不对称短路工况下，响水涧发电电动机的阻尼绕组温升计算值在运行实践和经验范围内，并具有一定的裕度，满足安全可靠运行要求。

用Excel 2016 软件进行数据处理并绘图，用SPSS 22.0 软件进行统计分析。实验数据均采用均值±标准差表示。组间差异显著性比较采用单因素方差分析（one-way analysis of variance,ANOVA）。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MRJPs 对小鼠体质量的影响

由图1可见，经MRJPs干预7周后，青年对照组小鼠体质量略有所增加，其余各组小鼠的体质量均未出现明显的变化，且各组间无统计学差异。

图1 MRJPs对小鼠体质量的影响Fig.1 Effects of supplemental MRJPs on body mass of mice

2.2 MRJPs 对小鼠卵巢指数和子宫指数的影响

由表2可见：与青年对照组相比，老年模型组小鼠的子宫指数和卵巢指数均显著下降（P＜0.05）。与老年模型组相比，MRJPs中剂量和高剂量组小鼠的子宫指数和卵巢指数均显著上升（P＜0.05），给予酪蛋白的阳性对照组则无显著变化。

表2 MRJPs对小鼠卵巢指数和子宫指数的影响Table 2 Effects of supplemental MRJPs on the ovarian index and uterine index of mice mg/g

2.3 MRJPs 对小鼠血清激素水平的影响

由表3可见：与青年对照组相比，老年模型组小鼠血清中E2和P的含量均显著下降（P＜0.05），FSH和LH 的含量显著上升，符合围绝经期雌性小鼠体内激素变化规律。而相对于老年模型组，MRJPs可提高小鼠血清中E2和P的水平（P＜0.05），降低血清中FSH 和LH 的水平（P＜0.05），并且表现出一定的剂量依赖性。由此可见，MRJPs对围绝经期雌鼠的激素水平具有双向调节作用。

表3 MRJPs对小鼠血清激素水平的影响Table 3 Effects of supplemental MRJPs on the serum hormone levels of mice

2.4 MRJPs 对小鼠子宫内膜厚度的影响

由图2可见：与青年对照组相比，老年模型组小鼠子宫内膜厚度显著减小（P＜0.05）。相对于老年模型组，MRJPs各剂量组小鼠子宫内膜厚度均有明显增加（P＜0.05）。

图2 MRJPs对小鼠子宫内膜厚度的影响Fig.2 Effects of supplemental MRJPs on the endometrial thickness of mice

2.5 卵巢中主要性激素受体基因的相对表达量

由图3可见：小鼠灌胃7周后，与老年模型组相比，MRJPs各剂量组小鼠卵巢组织中雌激素受体基因ERα和孕激素受体基因PR的表达量均显著升高（P＜0.05）；而与老年模型组相比，MRJPs低、中剂量组的雌激素受体基因ERβ的表达量稍有升高，高剂量组的ERβ表达量显著升高（P＜0.05）。

2.6 组织形态学观察

在光学显微镜下对各组小鼠卵巢进行形态学观察，结果见图4。1）青年对照组：可见较多的各级生长卵泡（包括成熟卵泡）以及黄体，卵泡形态大小各异，不少卵泡内清晰可见卵泡、卵泡液、卵丘；卵泡内初级卵母细胞大而圆，轮廓清晰，胞质着色清淡均匀，透明带着色稍深，与其周围的卵泡细胞界线分明；卵泡内颗粒细胞呈多层，核位于中央，呈空泡状，核液清亮，核仁清晰可见（图4A）。2）老年模型组：卵巢体明显萎缩，发育受阻且较差，卵泡生长少，未见成熟卵泡，部分被纤维组织所代替；黄体数量少，闭锁卵泡数量多（图4B）。3）MRJPs 各剂量组：与老年模型组相比，MRJPs 各剂量组的卵巢发育较好，卵泡生长活跃，卵泡液丰富，原始卵泡和生长卵泡数量均有所增多；偶见成熟卵泡，皮质、髓质层次分明，颗粒细胞层次较多且排列整齐；黄体可见且生长良好，闭锁卵泡数量有所减少（图4C～E）。

3 讨论

女性生殖内分泌的调节是通过下丘脑-垂体-卵巢轴（hypothalamic-pituitary-ovarian axis,HPOA）所构成的复杂的反馈系统来进行的。下丘脑通过分泌促性腺激素释放激素（GnRH）来促进垂体活动和分泌FSH 和LH。现代医学研究认为，卵巢功能衰退[25]导致的激素分泌水平显著降低是引发围绝经期综合征的主要原因。由于卵巢分泌的雌激素和孕激素减少，进而解除了雌激素对于下丘脑-垂体的负反馈抑制作用，使下丘脑-垂体-卵巢轴间的平衡失调，从而FSH和LH分泌量有代偿性增加，抑制卵泡的发育和卵子的生长，加速卵泡凋亡和闭锁，影响下丘脑-垂体调节机制及其他内分泌腺（如甲状腺、肾上腺）与垂体间的平衡关系，并干扰大脑皮层与自主神经系统的功能，从而产生各种临床表现及代谢紊乱。

图3 MRJPs 对小鼠卵巢中ERα、ERβ 和PR 基因相对表达量的影响Fig.3 Effects of supplemental MRJPs on the relative expression of ERα,ERβ and PR in ovaries of mice

图4 小鼠卵巢组织形态的HE染色观察Fig.4 Histomorphological observation of ovaries in mice byHE staining

以往研究报道表明，蜂王浆具有类雌激素效应。SALEM[26]研究发现：蜂王浆可作用于多个靶点，通过促进5-羟色胺和多巴胺分泌调节下丘脑神经元功能；通过观察模拟女性表现症状的去卵巢大鼠发现，蜂王浆可改善绝经后大鼠下丘脑-垂体-卵巢轴的功能。HIDAKA等[27]通过卵巢切除大鼠模型和骨组织培养模型研究，证明了蜂王浆对因大鼠卵巢切除术引起的骨质流失的预防功效与17β-雌二醇几乎相同。但近年来相关研究证明，蜂王浆的激素含量明显低于一般动物性食品性激素含量100 ng/g的检测下限标准，处于痕量水平[28]。因此，推测认为蜂王浆的类激素活性并非由蜂王浆本身所含的激素所致，而是由其活性蛋白成分产生的。

本实验选用了11～13月龄的雌性小鼠，并通过连续阴道细胞学观察，选取动情周期出现延长及紊乱表现的小鼠作为实验对象，符合围绝经期动物模型的阴道细胞学筛选要求。由衰老小鼠的血清激素水平检测结果可见，老年模型组小鼠血清中E2和P 水平显著降低，FSH 和LH 水平明显升高（P＜0.05），与以往对人体自然衰老研究报道的激素水平变化[29]一致，证明本文构建的围绝经期衰老模型是成功的。

子宫指数是评价受试对象雌激素效应的常用指标，与体内雌激素水平呈正相关关系。子宫增重试验是用来测试雌激素活性的经典实验方法。子宫组织内含有大量的雌激素受体，具有雌激素活性的物质在小鼠体内经过代谢产生活性物质并与受体结合，从而激活雌激素应答元件，诱发细胞内相关的反应，增加靶蛋白的表达，使子宫重量增加。本研究结果显示，与老年模型相比较，补充MRJPs可以提高围绝经期小鼠的子宫指数，这与雌激素含量上升和内膜增生密切相关。与此同时，与老年模型组相比，MRJPs各剂量组小鼠的卵巢指数也呈现出显著上升的趋势，这可能与MRJPs促进卵巢中卵泡的发育和生长有关。已经有相关报道证明，MRJPs不但可以显著促进大鼠肝细胞DNA的合成，增加白蛋白的合成量，还可以促进人体单核细胞的增殖，以及促进鼠科动物3T3-F442A前脂肪细胞的增殖以实现成熟脂肪细胞的转化[30-31]。

FSH 和LH 主要作用于卵巢，促进卵泡的发育成熟，受下丘脑促性腺激素释放激素及卵巢雌激素的共同协同作用的调控。女性进入围绝经期后，由于卵巢功能衰退，内分泌功能下降，雌激素分泌减少，进而解除了雌激素对于垂体的负反馈作用，导致FSH 和LH 的含量升高，对卵泡的发育和卵子的生长产生抑制作用。本实验结果显示，用MRJPs连续灌胃7 周后，血清中E2和P 的含量较老年模型组明显升高，FSH 和LH 的含量显著降低。表明MRJPs 对围绝经期小鼠激素水平具有双向调节作用，可明显调节衰老小鼠下丘脑-垂体-卵巢轴的失衡状态，为今后MRJPs和蜂王浆应用于预防和改善围绝经期综合征提供了科学依据。

激素活性是通过受体介导的，但是激素受体功能的发挥受多种因素调节，包括协同调节因子、蛋白翻译后修饰、受体基因转录水平等。雌激素的生理作用主要由ERα和ERβ受体亚型介导。本研究结果显示，MRJPs 中、高剂量组小鼠卵巢中ERα和ERβ的mRNA 表达量均显著增加，一方面可能是E2水平增加促进了雌激素受体的活化，另一方面也可能是MRJPs 直接作用于不依赖于雌激素受体活化的磷酸化过程，因有研究表明，存在一些信号通路可以不通过激素来激活雌激素受体[32]。MISHIMA等[33]通过体外实验已发现，蜂王浆能够以浓度依赖的方式抑制E2与雌激素受体（ERs）的结合，而与受体ERα和ERβ竞争性结合来调节雌激素敏感基因的表达，从而产生雌激素样作用。根据本实验结果推断，MRJPs 活化了雌激素受体基因的表达，从而促进了血清中雌激素含量的增加。但对引起雌激素受体表达量显著增加的分子机制目前尚不清楚，仍需进一步研究。

通过观察衰老小鼠卵巢和子宫的组织切片，发现闭锁卵泡数目多，黄体和成熟卵泡较少，而在MRJPs各剂量组中可见黄体数目呈现增多趋势，且发育良好，闭锁卵泡较少，各级卵泡清晰可见，说明MRJPs对促进卵泡发育、减缓卵巢功能衰退有一定的保护作用。

4 结语

本研究验证了MRJPs 作为蜂王浆发挥类雌激素效应的主要活性成分的有效性，为蜂王浆和MRJPs应用于延缓生殖系统老化、预防和改善围绝经期综合征提供了科学依据。长期应用外源性激素有致子宫内膜癌和卵巢癌的风险，而MRJPs冻干粉既保持了蜂王浆的功能特性，又克服了鲜王浆必须在－18 ℃冷冻才能保存活性成分的缺陷，作为既不含性激素，又具有雌激素样作用的一种新的功能蛋白，预期在围绝经期综合征的预防和改善方面具有广阔的应用前景。目前，运用MRJPs预防和改善围绝经期综合征的研究还处于探索性阶段，未来将重点针对MRJPs的作用机制进行深入研究。