简单重复序列标记和序列相关扩增多态性标记在草莓遗传多样性分析中的比较

忻雅，方献平,2，王淑珍，童建新，来文国，汪建荣，余红*

（1.杭州市农业科学研究院，杭州 310024；2.上海市农业科学院林木果树研究所，上海 201403）

我国的草莓产量占世界总产量的41.7%，是草莓生产第一大国[1]。草莓属（Fragaria）约有20个种，包括二倍体、四倍体、六倍体和八倍体种，其中仅起源于美洲种的弗州草莓和智利草莓自然杂交的八倍体凤梨草莓（Fragaria×ananassa）用于栽培。我国虽然分布着丰富的野生草莓资源，近几年也育成了108个自有品种[2]，但生产上应用的主要栽培品种多数引自国外。凤梨草莓遗传基础较狭窄，尤其在营养生长阶段，品种表型非常相似。草莓主要通过匍匐茎进行营养繁殖，不同地区引进相同品种，或者地区之间频繁引种，使得品种名称十分混乱，同物异名和同名异物的现象非常普遍[3]，给草莓品种的鉴定和种质资源的遗传多样性评价带来了很大的困扰。

对草莓种质资源的遗传多样性进行准确而客观的评价，分析其亲缘关系，可为资源引选、后代遗传变异程度及杂种优势水平的预测提供指导。分子标记已成为植物遗传多样性研究的重要工具，已有多种DNA分子标记应用于草莓种质资源的研究[4-5]。早期应用于草莓上的分子标记有扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism,AFLP）[6-7]、随 机扩增多态性DNAs（randomly amplified polymorphic DNAs,RAPD）及特定序列扩增（sequence characterized amplified regions,SCAR）标记[8-9]。而简单重复序列（simple sequence repeat,SSR）标记具有共显性、多态性丰富、重复性高、实验操作方便等特点，是近年来草莓遗传育种研究中主要使用的标记，已广泛用于草莓品种遗传多样性与亲缘关系分析中[10-12]。序列相关扩增多态性（sequence related amplified polymorphism,SRAP）标记是近年来发展的基于聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）的新型分子标记，其目标是检测基因组中的开放阅读框（open reading frame,ORF）的多态性，是一种无须任何序列信息即可直接进行PCR扩增的新型分子标记技术[13]，它既克服了RAPD重复性差的缺点，又克服了AFLP技术复杂、成本昂贵的缺点，以其操作简便迅速、成本低、可靠性好、重复性高等特点被广泛应用于植物遗传多样性分析、遗传图谱构建、基因定位克隆等方面[14]。已有研究表明，SRAP标记提供的信息量较SSR和AFLP更为丰富，具有更高的分辨能力[15-16]。但这种新型的分子标记技术在草莓上并未得到广泛应用，国内仅1篇关于其体系优化和引物筛选的报道[17]。因此，有必要研究SRAP在草莓亲缘关系分析中的可行性。此外，在以往草莓资源分析中多采用单一分子标记，而单一标记分析存在一定局限性[18]。因此，本研究利用SSR和SRAP标记对国内外43份草莓材料进行遗传多样性分析，并比较2种标记在其中的差异，以期为草莓品种选育、资源保存和利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试草莓品种共43份（表1），包括3份野生型草莓品种、32份八倍体的红草莓品种、3份白草莓品种、4份日中性草莓品种和1份十倍体草莓品种。品种材料由杭州市农业科学研究院生物技术研究所草莓育种团队收集并提供。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

准备43份不同草莓品种材料，各取幼叶约0.5 g，在液氮中碾磨成粉状，然后按Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]操作说明提取总DNA，用1%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的质量和完整性，将样品质量浓度统一稀释至50 ng/μL，保存于－20℃冰箱中，用于PCR扩增。

1.2.2 SSR-PCR

根据相关文献报道的序列[19]，合成了38对SSR引物（附表1，http://www.zjujournals.com/agr/CN/10.3785/j.issn.1008-9209.2018.10.261）。对SSR引物退火温度（50～64℃）进行梯度PCR测试，以确定不同SSR引物的适宜退火温度。SSR-PCR的反应体系（15 μL）包括：2 μL预混液（含Mg2+和Taq酶），1 μL DNA（50～100 ng），0.6 μL上、下游引物（0.4 μmol）和10.8 μL ddH2O。扩增条件为：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，适宜温度退火45 s，72℃延伸2 min，共35个循环；72 ℃延伸5 min。

表1 供试草莓材料Table 1 Strawberry cultivars used in this study

1.2.3 SRAP-PCR

根据SRAP引物的设计原理[13]，设计和合成了上游与下游引物各8条，组成64对引物（附表2，http://www.zjujournals.com/agr/CN/10.3785/j.issn.1008-9209.2018.10.261）。SRAP-PCR的反应体系（15 μL）包括：2 μL预混液（含Mg2+和Taq酶），1 μL DNA（50～100 ng），0.6 μL 上、下游引物（0.4 μmol）和10.8 μL ddH2O。扩增条件为：94 ℃变性5 min；前5个循环94℃变性1 min，36℃退火1 min，72℃延伸1 min；随后30～35个循环将复性温度提高到50℃，最后延伸5～7 min。

1.2.4 扩增产物的检测与统计分析

SSR和SRAP的扩增产物检测均采用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，进样量为1 μL，在Tris-硼酸缓冲液（TBE）中以110 V恒压电泳约2.5 h，银染检测，用扫描仪扫描电泳图谱并保存图像文件。

根据扩增后的电泳图谱，在相同迁移位点上，有带记为“1”，无带记为“0”，生成原始数据矩阵，采用公式[20]计算各材料间的遗传相似系数和遗传距离。根据BOTSTEIN等[21]报道的方法计算多态性信息含量（polymorphism information content,PIC）值。利用NTSYS-pc 2.10软件对数据进行分析，计算出各品种间的遗传相似系数，以非加权成对算术平均法（UPGMA）对材料进行聚类作图，并用Excel 2010检测这2种标记的遗传相似系数的相关性，以比较基于这2种标记分析所得结果的差异。

2 结果与分析

2.1 引物筛选及扩增多态性

2.1.1 SSR引物筛选及扩增多态性

经梯度PCR测试，确定了各引物的适宜退火温度；在所测试的38对SSR引物中，33对有扩增产物，其中30对SSR引物产物的扩增条带清晰，可用于对43份草莓材料的分析。如表2所示：30个SSR标记的扩增条带数在2～17条之间，多态性条带数为1～16条；试验共扩增出233个条带，平均每对引物7.77个条带；多态性位点193个，平均多态性位点数6.43个；43份材料所揭示的等位基因型数在2～29之间；平均PIC值达到0.628 4，其中以SB31的PIC值（0.045 4）最低，以SB23的PIC值（0.955 1）最高。

2.1.2 SRAP引物筛选及扩增多态性

根据初步测试结果，结合以往利用SRAP对其他园艺植物的扩增效果，选择了20个扩增产物条带较为清晰的SRAP引物组合对43份草莓材料进行了测试。如表3所示：不同SRAP标记的扩增条带数在8～22条之间，多态性条带数为7～20条；共扩增出324条带，平均每对引物16.20条；多态性位点286个，平均多态性位点数为14.30个；在43份材料中所揭示的等位基因型数在12～43之间；PIC值在0.708 6～0.976 7之间，20个标记的平均PIC值高达0.911 4，多态性明显高于所用的SSR标记。

表2 不同SSR标记的多态性Table 2 Polymorphism of different SSR markers

2.2 聚类分析

2.2.1 SSR标记的聚类分析

利用SSR标记数据对供试草莓品种的遗传相似系数计算表明，各材料间的相似系数在0.536～0.974之间，平均值为0.788。遗传相似系数较低，说明其遗传多样性相对丰富。根据已知系谱，晶瑶（5）与红颊（6）品种都是幸香（2）和章姬（1）品种的杂交后代，在本研究中达到了最高相似系数（0.974）。而红玉（3）品种是以红颊（6）品种为母本，再回交后选育而成的，因此与这2个品种的相似系数也较高，平均为0.957。野生白袍（16）、野生白草莓（17）和芦根（18）是野生草莓，因此与其他材料的差异较大，相似系数（0.624）小于总体平均相似系数。

43份材料的SSR标记聚类结果见图1。当遗传相似系数为0.805时，可将43份种质资源分为7大类群，包括5个复合组和2个独立组。桃熏（15）和芦根（18）各自聚为1支。复合组1和2包括日本品种和以日本品种为亲本的杂交种；复合组3是2个白草莓品种；复合组4主要是一些欧美品种，包括日中性品种；复合组5是2个野生品种。

2.2.2 SRAP标记的聚类分析

43份材料的SRAP标记聚类结果见图2。根据SRAP标记数据发现，不同材料间的相似系数在0.551～0.923之间，平均值为0.771，显示的遗传多样性比SSR标记更为丰富。幸香（2）与红玉（3）之间的遗传相似度最高（0.923），野生白草莓（17）与法国1号（27）之间的遗传差异最大，相似系数仅为0.551。与SSR标记分析结果一样，野生白袍（16）、野生白草莓（17）和芦根（18）与其他材料的差异较大，相似系数（0.616）小于总体平均相似系数。当遗传相似系数为0.783时，可将43份种质资源分为7大类群，包括3个复合组和4个独立组。点雪（19）、甜查理（8）、法国1号（27）、芦根（18）各自聚为1支。复合组1主要以日本品种和以日本品种为亲本的杂交种为主，但同时包括了十倍体桃熏（15）；复合组2主要是欧美品种和以其为亲本的杂交种，也包括日中性品种；复合组3是2个野生品种。

表3 不同SRAP标记的多态性Table 3 Polymorphism of different SRAP markers

图1 43个草莓品种的SSR标记聚类图Fig.1 Dendrogram of 43 strawberry cultivars based on SSR markers

2.2.3 SSR和SRAP联合标记的聚类分析

对43份材料进行SSR-SRAP联合标记的聚类结果见图3。将SSR和SRAP数据整合后，各材料间的相似系数在0.577～0.932之间，平均值为0.778，晶瑶（5）与红颊（6）之间的遗传相似度最高，相似系数达到0.932。3个野生品种与其他材料的差异较大，相似系数（0.691）小于总体平均相似系数。当遗传相似系数为0.798时，可将43份种质资源分为7大类群，包括4个复合组和3个独立组。桃熏（15）、甜查理（8）、芦根（18）各自聚为1支。复合组1主要包括日本品种和以日本品种为母本的杂交种；复合组2主要是欧美品种和以其为亲本的杂交种；复合组3是4个日中性品种；复合组4是2个野生品种。

2.2.4 SSR和SRAP标记的遗传分析比较

对这2种标记的聚类结果进行相关性分析，结果表明，基于SSR标记的聚类结果与基于SRAP标记的聚类结果的相关系数为0.817。而SSR标记、SRAP标记分别与SSR+SRAP联合标记的相关系数为0.938和0.966，都达到极显著水平。从最大相似系数来看，SSR+SRAP联合标记与SSR标记的结果一致，即晶瑶（5）与红颊（6）之间的相似系数最大。从聚类结果来看，SSR+SRAP联合标记与SRAP标记或者SSR标记的聚类结果都有相似之处，是2种标记分析结果的综合。与单独种类的标记聚类结果相比，2种标记整合后的聚类分析结果（图3）与草莓已知系谱[2]的吻合度更高，更能反映品种间的系谱关系。

3 讨论

3.1 SSR和SRAP标记的比较

图2 43个草莓品种的SRAP标记聚类图Fig.2 Dendrogram of 43 strawberry cultivars based on SRAP markers

图3 43个草莓品种的SSR和SRAP标记聚类图Fig.3 Dendrogram of 43 strawberry cultivars based on SSR+SRAP markers

本研究首次采用SSR和SRAP标记相结合的方式对草莓种质资源的遗传多样性进行分析。对43份草莓分析的结果显示，在平均多态性条带数、多态率、基因型数及PIC值等多态性参数上，SRAP均高于SSR。这一方面说明用SRAP标记比SSR标记更容易获得大量的多态性条带，这种趋势在油菜[22-23]、马铃薯[24]、柑橘[25]、苦荬菜[26]、苦瓜[27]等作物的资源分析上已经得到了证实，但不同报道中SRAP标记的多态性参数存在差异，这主要是所用物种及品种间的遗传背景不同造成的；另一方面也表明SRAP在揭示不同材料遗传多样性方面的性能要优于SSR。2种标记间产生的多态性差异与它们对基因组进行扩增时引物结合位置的不同有直接的关系，也可能与所用材料有关。SRAP引物是根据基因外显子和内含子中碱基组成的特点设计，对全基因组表达基因进行扩增，在不同个体和种间因为内含子、启动子与间隔区长度不等而产生多态性[28]，而SSR标记的多态性是由基因组DNA复制时的滑动和错配等引起的重复序列变化而产生的，检测的是基因组中局部重复基元的变异，因此所揭示的等位基因的变异数要少于SRAP标记。

凤梨草莓本身遗传基础比较狭窄，本研究所用材料有30个日本或国内选育品种的亲本，重合率非常高，另外也包含了4个法国品种、6个美国品种和3个野生品种，但这2种标记均能揭示出草莓不同材料间的丰富遗传变异。可以认为，这2种标记均适用于草莓的遗传多样性分析，而且非常适合对大量种质的遗传变异进行检测。SSR和SRAP标记的遗传相似系数矩阵达到显著相关，相关性（r＝0.817）远大于这2种标记在油菜[22]、马铃薯[24]、苎麻[29]中的相关性，可能与本研究中草莓材料的遗传背景比较相似有关。SRAP标记与SSR+SRAP联合标记的相关系数（0.966）高于SSR标记与SSR+SRAP联合标记的相关系数（0.938），都达到显著水平。因此，基于SRAP标记得出的结果比基于SSR标记的结果更接近基于联合标记的结果，说明SRAP在揭示不同品种遗传多样性方面其性能要优于SSR。这可能因为SSR与SRAP标记揭示基因组位置不同，也可能与本实验中SRAP标记扩增出的多态性条带数目更多有关。从聚类结果来看，整合后的聚类分析能更全面、客观、有效地揭示草莓种质之间的遗传多样性。

3.2 SSR和SRAP在分析草莓遗传多样性中的应用

杂交选育是我国草莓育种的主要途径，占我国草莓品种育成的88.0%。综合性状优良且差异较大的品种是选育优质抗病草莓品种的最好亲本，红颊和甜查理因此成为衍生品种数最多、遗传贡献值最大的2个品种[2]。目前，草莓分子标记在遗传多样性研究上的应用主要体现在品种鉴定和种群进化与基因组结构分析2个方面，在遗传图谱构建、数量性状位点（QTL）定位结合测序方面还与其他果树具有较大差距[1]。

SRAP标记主要揭示与表达基因相关的信息，是油菜上通过鉴定亲本遗传多态性预测杂种优势的有效分子标记手段，效果要显著优于SSR标记[23]。而SSR标记更多地反映了全基因组的遗传丰富度，同时对于以远缘杂交等方式渗入的其他物种基因片段具有较好的检测能力，有利于遗传多样性的保存。SSR标记与形态学相结合可以鉴定五叶草莓或绿色草莓与凤梨草莓种间杂交F1代[30-31]，王壮伟等也利用4对SSR引物区分了亲缘关系较近的29个欧美品种[32]，黄志城等利用20对SSR引物构建了96份草莓品种的DNA指纹图谱[33]。因此，SSR标记与SRAP标记的组合应用，既能保存遗传多样性，又能较好地利用杂种优势，有利于草莓的中长期育种。总之，SSR标记与SRAP标记的组合应用，同时综合应用测序、单核苷酸多态性（SNP）芯片、全基因组关联分析等手段，有利于高密度遗传图谱的构建，进行广泛的性状连锁分析和基因挖掘，提高分子育种的精确度，推动草莓产业发展。

4 结论

本研究筛选出30对SSR引物和20对SRAP引物组合用于43个草莓品种的遗传多样性分析，结果表明，SRAP标记比SSR标记可获得更多的多态性条带。2种标记都在一定水平将欧美系草莓品种和日本系草莓品种各聚为一类，而2种标记整合后的聚类分析结果更能真实地反映草莓的已知系谱关系。本试验研究结果可作为鉴定草莓品种的科学依据，为中国草莓新品种选育等方面的研究奠定基础。