当归半夏汤及其拆方对人卵巢癌细胞HO-8910分泌雌二醇的作用*

徐 娜,宋雪杰,司季青,王芝敏,张晓静,梁 雪,司富春,赵 化

(1.河南省生殖健康科学技术研究院,河南 郑州450002; 2.河南中医药大学中医药科学院河南省中医方证信号传导重点实验室,河南 郑州 450046; 3.河南省中医院,河南 郑州 450002)

雌激素主要由卵巢颗粒细胞合成和分泌,雌二醇(estradiol,E2)是雌激素中生物活力最强的类固醇激素,具有抗雄激素、促进子宫内膜增生、增强子宫平滑肌收缩等作用[1-3]。当前生活习惯、环境等因素影响下,E2低水平导致的多囊卵巢综合征、不孕、卵巢早衰等成为育龄女性的常见疾病,其中多囊卵巢综合征的发病率较高。据报道,世界女性多囊卵巢综合征发病率为4%～12%,占育龄期女性的5%～10%,由其导致的不孕占无排卵性不孕的50%～70%。此外,卵巢早衰发病率为1%～3%[4-6]。对于E2低水平所致的多囊卵巢综合征等疾病,目前西医学多采用激素药物对症治疗,显效较慢,易复发,有高排卵率、高流产率、低妊娠率等不良反应。深入研究可促进E2分泌的治疗方法和有效药物是治疗该类疾病的关键。前期笔者从调节卵巢颗粒细胞性激素分泌的295种中药中筛选出当归、山茱萸、白芍、女贞子、龟板、清半夏、浙贝母、川芎、牡丹皮、赤芍、丹参、柴胡12味有效中药组成当归半夏汤。本研究在此基础上进一步优化筛选,研制能调节E2分泌的高效方剂,并研究其对E2分泌的调节作用,以期为此类疾病的临床治疗、研究和药物开发提供有效实验基础。卵巢颗粒细胞是卵巢的主要功能细胞,其增殖与分化直接影响卵泡的生长启动、发育、排卵、黄体形成及甾体激素分泌等活动。本实验选取可分泌E2的人卵巢癌细胞HO-8910作为研究对象。

1 材料与方法

1.1 细 胞

人卵巢癌细胞HO-8910,购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心。

1.2 药品、试剂及仪器

当归半夏汤药物组成:当归、山茱萸、白芍、女贞子、龟板、清半夏、浙贝母、川芎、牡丹皮、赤芍、丹参、柴胡。药材均购自河南中医药大学第三附属医院。取上述12味中药各50 g,分别避光浸泡于250 mL 体积分数 950 mL /L乙醇中;振荡,2次/d;7 d天后将每味中药的乙醇提取物过滤,旋蒸,浓缩,干燥;待药物充分干燥后,称取适量中药,先配制成300 g/L的二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)药液,再用培养基稀释成4 g/L的药物储备液;0.22 μm滤头过滤除菌,-20 ℃冰箱保存备用;实验时配制成所需质量分数的药液。950 mL /L 分析纯乙醇,天津市恒兴化学试剂制造有限公司产品,批号20201210;RPMI 1640培养基,赛默飞世尔科技公司GIBCO品牌产品,批号2333386;胎牛血清,上海双洳生物科技有限公司LONSERA胎牛血清,批号OH12343;胰蛋白酶、青链霉素混合液(100×)、噻唑蓝溴化四唑(MTT)、DMSO,均为北京索莱宝科技有限公司产品,批号依次为12271041、20200626、917Q057、1121E0333。RE-6000A型旋转蒸发仪,上海亚荣生化仪器厂产品;DK-S24型电热恒温水浴锅,上海精宏实验设备有限公司产品;DZF-6050型真空干燥箱,德国宾德公司产品;HERA cell 150Heraeus细胞培养箱,美国科峻公司(Kendro)产品;Axiovert25倒置荧光显微镜,蔡司光学仪器(上海)国际贸易有限公司产品;EPOCH型酶标仪,美国伯腾仪器有限公司产品。

1.3 细胞培养

将细胞置于体积分数 50 mL /L CO2、37 ℃、饱和湿度培养箱中培养,当细胞汇合率为70%～80%时,给予含乙二胺四乙酸胰蛋白酶消化传代处理,2～3 d传代1次。细胞消化处理后,使用细胞计数仪计算细胞浓度,取1×106个细胞接种于直径10 cm培养皿中,显微镜下观察细胞生长状态。

1.4 当归半夏汤中单味中药的筛选

设空白对照组和加药组,每组3个复孔。取生长旺盛的HO-8910细胞,用胰蛋白酶消化处理为单细胞悬液,用不含血清的1640培养基以1×104个细胞/孔接种于1.5 mL EP管中,100 μL/孔,置于37 ℃、体积分数50 mL /L CO2、饱和湿度培养箱中培养。适应性培养30 min后,空白对照组每孔加100 μL 1640培养基;加药组将当归半夏汤中12味待选中药储备液配成质量分数200 mg/L的工作液,每孔加入100 μL,使药物最终质量分数为100 mg/L;继续培养24 h;将EP管以离心半径5 cm、转速1 000 r/min离心10 min,收集细胞上清。采用放射免疫测定(radioimmunoassay,RIA)法测定各组上清液中E2含量,筛选出对HO-8910细胞增殖无显著影响但可促进E2分泌的药物。中药促进细胞E2分泌百分比(%)=(加药组单位细胞分泌E2水平-空白对照组单位细胞分泌E2水平)/空白组单位细胞分泌E2水平×100%

1.5 单味药量效关系检测

取生长旺盛的HO-8910细胞,用胰蛋白酶消化处理为单细胞悬液,用不含血清的1640培养基以1×104个细胞/孔接种于96孔培养板,100 μL/孔,置于37℃、50 mL /L CO2、饱和湿度培养箱中培养。设空白对照组和加药组,每组3个复孔。根据1.4项下药材筛选结果,把各入选药物分别配制成质量分数为3.125、6.25、12.5、25、50、100、200、400 mg/L 8个梯度药液,进行药物剂量-药理效应实验。加药方法同1.4,空白对照组每孔加100 μL 1640培养基,中药组加入不同质量分数药液,继续培养24 h;收集细胞上清,采用RIA法测E2水平;收集上清,每孔加入100 μL MTT,培养箱中继续培养4 h后去掉上清;每孔加入150 μL DMSO溶液,酶标仪测定OD值。计算空白对照组和加药各组单位细胞分泌E2水平(即E2水平/相应OD值)。采用GraphPad Prism 8.0.1软件,以药物质量分数为横坐标、药物促进HO-8910细胞E2分泌百分比为纵坐标绘制剂量-效应关系曲线,求出单味药促进E2分泌的半数效应浓度(median effect concentration,EC50)。

1.6 当归半夏汤全方及拆方对HO-8910细胞E2分泌的量效关系

将1.4项下筛选出的8味中药按照功效分为补肾养血(酒萸肉、当归、白芍)、化痰(浙贝母、清半夏)和活血(丹参、牡丹皮、赤芍)3类,分别组成补肾养血方、化痰方和活血方。设3个拆方组和1个全方组,分别以各组方中单味药EC50值的0.031 25、0.062 5、0.125、0.25、0.5、1、2、4倍的量进行混合,同时设空白对照组,每组3个复孔。加药和结果测定方法同1.5,计算空白对照组和加药各组HO-8910细胞分泌的E2水平。采用GraphPad Prism 8.0.1软件,以药物质量分数为横坐标、药物促进HO-8910细胞E2分泌百分比为纵坐标绘制剂量-效应关系曲线,求出当归半夏汤全方和补肾养血、化痰、活血拆方的EC50。

1.7 当归半夏汤全方及拆方对HO-8910细胞E2分泌作用的时效关系

全方组及拆方组分别以各组方中单味药EC50值进行混合,同时设空白对照组,每组3个复孔。细胞处理和加药同1.5,采用MTT比色法检测12、24、36、48、60、72 h 6个时间点全方及3个拆方促进HO-8910细胞E2分泌百分比,绘制时效关系曲线,确定时间-药效关系。

1.8 统计学分析

采用GraphPad Prism 8.0.1软件对数据进行统计分析,计算EC50[7]。

2 结 果

2.1 当归半夏汤中单味中药的筛选结果

以质量分数100 mg/L的各单味中药作用24 h,得到对HO-8910细胞增殖无显著影响但对E2分泌有明显促进作用的8味中药,分别是酒萸肉、当归、白芍、浙贝母、清半夏、丹参、赤芍和牡丹皮。见表1。此8味中药作用HO-8910细胞24 h,对细胞形态无显著影响,细胞呈不规则椭圆形或梭形,核浆比较丰富。

表1 当归半夏汤中12味中药对HO-8910细胞分泌E2的影响

2.2 8种中药与HO-8910细胞E2分泌的量效关系

8味中药对HO-8910细胞E2分泌的促进作用随着药物质量分数的增加而增强,见表2。经GraphPad Prism 8.0.1统计软件计算,各单味药的EC50分别是:酒萸肉 198.7 mg/L,当归 162.8 mg/L,白芍342.1 mg/L,浙贝母116.5 mg/L,清半夏 486.8 mg/L,丹参 82.83 mg/L,牡丹皮 143.9 mg/L,赤芍 218.8 mg/L。

表2 不同质量分数的8种药物促进HO-8910细胞E2分泌百分比

2.3 当归半夏汤全方及拆方与HO-8910细胞E2分泌的量效关系

补肾养血方、化痰方、活血方及当归半夏汤全方均可促进HO-8910细胞E2分泌,对E2分泌的促进作用随药物质量分数的增加而增强,见表3和图1。作用大小依次为:全方>活血方>补肾养血方>化痰方。补肾养血方组、化痰方、活血方及全方所含各单位中药的EC50依次是上述2.2项下量效关系得出的单位中药EC50的0.47、0.90、0.30、0.19倍。

图1 当归半夏汤全方及拆方促进HO-8910细胞

表3 不同剂量当归半夏汤全方及拆方促进HO-8910细胞E2分泌百分比

2.4 当归半夏汤全方及拆方与HO-8910细胞E2分泌的时效关系

补肾养血方、化痰方、活血方及全方均可促进HO-8910细胞E2分泌,对E2分泌的促进作用在12～48 h之间随时间的增加而增强,见表4和图2。

图2 当归半夏汤全方及拆方促进HO-8910细胞E2分泌时效关系对比

表4 不同作用时间当归半夏汤全方及拆方促进HO-8910细胞E2分泌百分比

3 讨 论

E2是雌激素中最主要、活性最强的激素。基于E2在生殖系统中的重要作用,本研究运用可分泌E2的人卵巢癌细胞HO-8910建立调节E2分泌的药物筛选方法,在前期初步筛选所得12味有效中药基础上进一步筛选,得到可促进HO-8910细胞E2分泌的酒萸肉、当归、白芍、浙贝母、清半夏、丹参、赤芍、丹皮8味中药,并探究其与E2水平的量效和时效关系,为E2低水平导致的不孕、卵巢早衰、多囊卵巢综合征、月经不调等疾病临床治疗和药物研发提供新的依据。由8种中药组成的当归半夏汤及补肾、化痰、活血拆方与多囊卵巢综合征、卵巢早衰、不孕的中医病机相合。中医学认为,肾主生殖,为先天之本。肾中精气充盈,滋养五脏六腑,维持正常的生长发育。对于女性而言,肾精充足,肾阴肾阳得以相互转化,滋养天癸,冲任调畅,经水应期而至,正常行经受孕。若肾中精气亏虚,肾阴肾阳失衡,转化不利,则会引起人体生长和生殖机能障碍。肾阴是卵泡生长发育的物质基础,能滋养孕卵促其生长成熟;肾阳是卵子排出的内在动力,能鼓动卵子顺利排出;因此,肾虚是生殖内分泌功能异常、雌激素分泌异常的主要原因[8-10]。同时,肾为水脏,与体内水液调控密切相关。若肾气不足,肾阳虚损影响气化功能,蒸腾气化失司而影响津液代谢,湿邪停滞,阻遏气机,则聚集成痰;此外,气虚血瘀,瘀血凝滞胞宫或湿浊流注冲任胞宫,使冲任失调,引起月经失调;或肾虚不能摄精成孕,而致不孕。因此,治疗E2分泌水平低导致的不孕、卵巢早衰、多囊卵巢综合征、月经不调等疾病,应顺应肾中阴阳消长的生理变化,进行补肾、活血、化痰[11-13]。酒萸肉补益肝肾,固冲任;当归补血调经;白芍敛阴养血;酒萸肉、当归、白芍补肝肾,养血;浙贝母清热化痰;生半夏燥湿化痰;丹参活血调经;牡丹皮、赤芍活血祛瘀。8味药共奏补肾养血、化痰活血之效。雌激素分泌减少是育龄妇女发生生殖内分泌功能异常疾病的主要原因,本研究得出的当归半夏汤可为雌激素减少而引起的生殖内分泌功能异常所致的不孕、月经紊乱等的临床治疗、研究和药物开发提供了研究基础。