昆布多糖通过ERK通路对子宫内膜异位症模型大鼠异位病灶及血管新生的抑制作用*

赵哲君,闫 霜,年卫红,陈雁南

(1.河南省荣军医院妇产科,河南 新乡 453003; 2.郑州大学第三附属医院妇科,河南 郑州 450052)

子宫内膜异位症是临床常见的妇科疾病,多见于育龄期女性,临床表现为下腹坠痛、痛经、经期紊乱、不孕等[1]。目前临床对子宫内膜异位症尚无标准治疗方式,多采用抗炎、止痛药物配合抗雌激素药物,通过降低炎症反应、抑制血管生成来缓解疼痛,但长期服用会导致子宫萎缩且存在停药复发现象[2]。中医学认为子宫内膜异位症的病机以瘀血内停、肾虚血瘀为主,治疗宜以活血化瘀、补肾利水为主。昆布取自海带科植物海带或翅藻科植物昆布的干燥叶片,可消痰软坚散结,利水消肿,常被用于生殖系统疾病的治疗。昆布多糖(laminarin,LA)提取自昆布,是一种天然海洋生物多糖,具有抗炎、抗病毒、降血压、降血脂、保护血管等多种生物医学功能[3]。研究[4]表明,LA可通过抑制一氧化氮生成、抑制炎症刺激下的脑血管内皮细胞增殖治疗大鼠化脓性脑膜炎,推测其可对血管内皮细胞产生影响。本研究通过建立子宫内膜异位症大鼠模型,探究LA对其异位病灶及血管新生的抑制作用,并探讨相关机制。

1 材料与方法

1.1 动 物

无特定病原体级SD大鼠45只,雌性,7周龄,体质量(200±10)g,购自北京安凯毅博生物技术有限公司,实验动物生产许可证编号为SCXK(京)2017-0006,动物质量合格证号为2019A035。实验场所的使用许可证编号为SYXK(豫)2021-0013。

1.2 药品、试剂与仪器

LA,纯度99%,上海谷研实业有限公司产品,批号9008-22-4;细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)通路激动剂表皮细胞生长因子(epidermal growth factor, EGF),美国默克公司产品,批号62229-50-9;免疫组织化学染色试剂盒,上海一基实业有限公司产品,批号YJ1012608;血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒,武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司产品,批号PKSM041180;兔抗大鼠CD31、p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)、磷酸化p38 MAPK(phospho-p38 MAPK, p-p38 MAPK)、ERK1/2、磷酸化ERK1/2(phospho-ERK1/2,p-ERK1/2)一抗,均为美国艾博抗公司产品,批号依次为ab9498、ab221012、ab284564、ab176640。BX53M显微镜,日本奥林巴斯株式会社产品;680酶标仪、GelDoc go凝胶成像分析系统,均为美国伯乐公司产品;DYY-16D电泳仪,北京六一生物科技有限公司产品。

1.3 模型的建立与分组

参照参考文献[5],采用自体移植法建立子宫内膜异位症大鼠模型。取45只SD大鼠,术前2 d灌胃戊酸雌二醇0.5 μg/g使其统一处于发情期。腹腔注射戊巴比妥钠麻醉,固定大鼠于手术台;下腹正中切口,分离左侧子宫;结扎子宫两端并切取中间一段子宫,置于无菌磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer solution,PBS)中,分离出子宫内膜,迅速贴于右侧内腹壁,用可吸收线固定两端;逐层缝合切口并关腹。术后将大鼠置于干净鼠笼保温至苏醒,肌肉注射青霉素3万U/只预防感染,1次/d,持续3 d。随机选择10只大鼠设为假手术组,不切取子宫,不进行子宫内膜移植,其余操作同前。术后6周开腹,异位内膜生长为扁球体囊状物,内部充满液体,表面可见清晰血管,即为造模成功。32只大鼠造模成功,随机分为模型组11只、昆布多糖组11只、激动剂组10只。采用游标卡尺测量各组大鼠异位病灶的长、宽、高,计算异位病灶的体积,记为V前。体积测量完成后用青霉素粉撒于切口处预防感染,常规关腹。

1.4 干预方法

造模成功24 h后,参照参考文献[6]对各组大鼠进行干预。激动剂组灌胃500 μg/g LA混悬液(生理盐水配制),灌胃体积10 μL/g,2 h后尾静脉注射10 ng/g EGF溶液;昆布多糖组灌胃500 μg/g LA混悬液,灌胃体积10 μL/g,1次/d;假手术组、模型组给予生理盐水10 μL/g体质量,1次/d。各组均连续干预7 d。

1.5 检测指标

末次干预后次日,腹腔注射戊巴比妥钠,开腹,观察异位内膜生长情况,测量体积并记为V后。测量后脱颈处死大鼠,腹腔注射生理盐水3 mL,灌洗腹腔;收集灌洗液,以离心半径8 cm、转速2 000 r/min冰上离心10 min;收集上清液置于4 ℃保存用于ELISA实验。切取部分异位子宫内膜组织(假手术组取在位子宫),分成2份。1份经质量分数40 g/L 聚甲醛固定24 h,梯度酒精脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,切片,进行免疫组织化学染色及苏木精-伊红(hematoxylin and eosin,HE)染色;1份在液氮中保存,用于蛋白质印迹实验。

1.5.1 子宫内膜生长抑制率

按以下公式计算子宫内膜生长抑制率。子宫内膜生长抑制率=(V前-V后)/V前×100%

1.5.2 异位子宫内膜微血管密度

采用免疫组织化学染色法观察。取异位子宫内膜组织切片,常规脱蜡,PBS清洗,加入体积分数30 mL/L过氧化氢溶液处理10 min,滴加抗原修复液微波修复抗原,待冷却至40 ℃,加入体积分数50 mL/L 胎牛血清封闭30 min,加入兔抗大鼠CD31一抗(1︰500),4 ℃孵育过夜,PBS清洗,加入二抗(1︰2 000),37 ℃孵育15 min,PBS清洗,加入DAB显色液,蒸馏水冲洗,苏木精复染,酒精脱水,二甲苯透明,滴入中性树胶封片,光学显微镜下观察。以单个内皮细胞或细胞群为一个血管,高倍镜下选择5个不相邻的血管密集区视野,记录棕黄色CD31阳性细胞数,以阳性细胞占比(棕黄色细胞数/总细胞数×100%)代表微血管密度。

1.5.3 腹腔灌洗液VEGF水平

采用ELISA法检测。取灌洗液上清液,用酶标仪检测450 nm位置处吸光度(A)值。操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.5.4 异位子宫内膜组织病理学形态

取各组异位子宫内膜组织,切片,常规脱蜡,HE染色,光学显微镜下观察子宫内膜组织病理学形态。

1.5.5 异位子宫内膜组织p38 MAPK、p-p38 MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达

采用蛋白印迹法检测。取液氮保存的子宫内膜组织,用眼科剪剪碎后研磨,加入PBS匀浆,注入RIPA裂解液,置于离心管内,以离心半径10 cm、转速9 000 r/min冰上离心12 min,采用二喹啉甲酸(BCA)法检测蛋白质水平。取50 μg待测蛋白,与3倍比例上样缓冲液混合,100 ℃水浴变性,行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,湿转至PVDF膜,常温下加入50 g/L脱脂牛奶封闭1 h,TBST洗膜,加入兔抗大鼠p38 MAPK、p-p38 MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2一抗(1︰500),4 ℃摇床孵育过夜,TBST洗膜,加入二抗(1︰2 000),常温孵育2 h,ECL显色,暗室曝光,经凝胶成像分析系统扫描并分析,计算p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2比值。

1.6 统计学方法

2 结 果

2.1 各组子宫内膜生长抑制率对比

与模型组对比,昆布多糖组子宫内膜生长抑制率升高,差别有统计学意义(P<0.05)。与昆布多糖组对比,激动剂组子宫内膜生长抑制率降低(P<0.05)。见表1。

表1 各组子宫内膜生长抑制率对比

2.2 各组子宫内膜组织微血管密度对比

与假手术组对比,模型组CD31阳性细胞占比升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组对比,昆布多糖组阳性细胞占比降低(P<0.05)。与昆布多糖组对比,激动剂组阳性细胞占比升高(P<0.05)。见表2、图1。

注:箭头所示为CD31阳性细胞。

表2 各组子宫内膜组织微血管密度对比

2.3 各组腹腔灌洗液VEGF水平对比

与假手术组对比,模型组腹腔灌洗液VEGF水平升高(P<0.05)。与模型组对比,昆布多糖组腹腔灌洗液VEGF水平降低(P<0.05)。与昆布多糖组对比,激动剂组腹腔灌洗液VEGF水平升高(P<0.05)。见表3。

表3 各组腹腔灌洗液VEGF水平对比

2.4 各组子宫内膜组织病理学形态对比

假手术组子宫内膜腺上皮细胞结构完整、排列整齐,腺腔完整,腺体较多。模型组子宫内膜腺上皮细胞细胞核体积增大、排列不规则,腺体细胞数量增加,大多上皮细胞出现核下空泡,部分可观察到内膜囊腔。与模型组对比,昆布多糖组、激动剂组子宫内膜腺上皮细胞排列较为整齐,腺体细胞数量减少,腺腔缩小。其中昆布多糖组子宫内膜组织病理学形态改善情况优于激动剂组。见图2。

图2 各组子宫内膜组织病理变化(HE染色,×200)

2.5 子宫内膜组织p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2对比

与假手术组对比,模型组子宫内膜组织p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2升高(P<0.05)。与模型组对比,昆布多糖组子宫内膜组织p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2降低(P<0.05)。与昆布多糖组对比,激动剂组子宫内膜组织p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2升高(P<0.05)。见表4、图3。

图3 子宫内膜组织p38 MAPK、p-p38 MAPK/、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达

表4 各组大鼠子宫内膜组织p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2对比

3 讨 论

子宫内膜异位症是子宫内膜组织转移至非正常位置形成的慢性炎症疾病,表现为子宫内膜腺体及间质侵袭至宫腔之外的部位及其他器官,形成异位结节并浸润生长[7]。目前子宫内膜异位症的发病机制尚不完全清楚,通常认为经血逆流导致内膜间质细胞种植于非正常位置而发展为异位病灶;并在雌激素的作用下,血管内皮组织增殖能力提升,血管通透性增强,引发血管异常增生,促进异位病灶组织生长[8]。鉴于雌激素对维持女性生理健康具有重要作用,寻找高效、低副作用抑制血管新生且不影响雌激素分泌的药物对于抑制异位病灶发展、恢复患者生育能力意义重大。子宫内膜异位症属于中医学“痛经”“癥瘕”“不孕”等范畴,病机主要为瘀血阻滞冲任胞宫,气阻为癥,血结为瘕,气血失和,肾虚血瘀,冲任不调,胞宫受阻,进而发病。治疗宜以活血化瘀、补肾利水为主[9]。

CD31是一种血小板-内皮细胞黏附因子,参与血管壁构成,可证明血管内皮组织存在,反映微血管密度,因此常被作为标记物评估微血管生成[10]。VEGF是直接作用于血管内皮细胞的关键刺激因子,其腹腔液含量与异位子宫内膜组织血管新生能力呈正相关[11]。中药昆布性寒,味咸,归肝、胃、肾经,可消痰,利水[12]。LA是从昆布中分离出的天然活性物质,主要包括褐藻胶、褐藻淀粉及褐藻糖,可抗凝血,抗辐射,抗氧化,降低尿酸[13]。本研究结果显示,与模型组对比,昆布多糖组子宫内膜生长抑制率升高,CD31阳性细胞占比、腹腔灌洗液VEGF水平降低,提示LA可抑制异位子宫内膜生长及内膜组织血管新生。

MAPK/ERK通路是将胞外刺激信号传递至细胞及其核内的重要信号通路,广泛存在于哺乳动物细胞内,在细胞增殖、分化、迁移、凋亡等过程中发挥重要作用[14]。p38 MAPK、ERK是该通路重要调控蛋白,均属于丝裂原活化蛋白激酶家族。p38 MAPK被上游激酶激活后,其残基发生磷酸化,由胞浆转移至胞核,促使相关炎症因子基因转录,依次激活下游环节,活化ERK1/2使之磷酸化,逐级磷酸活化下游酶蛋白,产生瀑布样级联反应信号,增强炎症反应、促进血管内皮细胞增殖迁移[15]。研究[16]认为,激活ERK信号通路可促进乳腺癌细胞转移及血管新生,增加其微血管密度,进而促进肿瘤发展,提示ERK信号通路在血管新生中具有一定作用。本研究结果显示,与假手术组对比,模型组子宫内膜组织p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2升高,经LA干预后均降低,且在LA基础上增用ERK通路激动剂EGF可减弱LA对子宫内膜异位症的治疗作用,提示:MAPK/ERK信号通路在子宫内膜异位症中被异常激活,LZ可能通过抑制该通路对大鼠子宫内膜异位症产生治疗作用。

综上所述,LA可抑制异位子宫内膜生长及内膜组织血管新生,从而治疗大鼠子宫内膜异位症,抑制MAPK/ERK通路可能是其机制之一。