基于网络药理学研究玄参治疗糖尿病足的作用机制*

刘骏逸，程卫东，李朝晖，刘晓东，彭 鹏，申 晟

[1.河南省洛阳正骨医院(河南省骨科医院)，河南 郑州 450000； 2.珠海市中西医结合医院，广东 珠海 519000]

根据国际糖尿病协会统计，2015年的全球糖尿病患者总数已经达到4.15亿，到2040年预期将达到6.42亿人，其中接近3/4的糖尿病患者生活在低中收入水平国家[1]。糖尿病足(diabetic foot，DF)属于糖尿病较为严重的并发症之一，也是最常见的截肢原因[2]。据估计，每年有19%～34%的糖尿病患者发生糖尿病足；约40%的糖尿病足愈合患者在1年内溃疡复发，60%的患者3年内复发，65%的患者5年内复发[3]。多种因素均可导致糖尿病足的复发，而糖尿病足的复发将对患者的心理及生理产生极大的不良影响，且会增加患者关于伤口处理所产生的经济负担[4]。最近一项Meta分析显示：DF患者的性别、既往DF溃疡时长、吸烟、跖侧面溃疡、糖尿病患病时长及周围血管病变、神经病变均为DF发生的风险因素[5]。

DF的治疗十分困难，且其预后受全身、局部、治疗等多方面影响。在治疗糖尿病足的过程中，中西医结合疗法具有明显优势。四妙勇安汤为治疗糖尿病足的代表方剂之一[6-7]，由金银花、玄参、当归、甘草4味药物组成，是治疗脉管炎、脱疽热毒炽盛证的经典名方。方中玄参清热凉血，泻火解毒。现代药理学研究表明：玄参为玄参科植物玄参的根，具有舒张血管、降血糖、抗炎、抗菌、抗癌等作用，在治疗DF中起到了至关重要的作用[8-9]。但是由于中草药所含成分的多样性，目前对于玄参治疗糖尿病足的作用机制尚不完全清楚。笔者采用网络药理学技术，通过“疾病表型-基因-靶点-药物”的模式，全方位、多角度深入研究玄参治疗糖尿病足的作用机制，以期为深入研究玄参及含有玄参的中药复方治疗糖尿病足的临床运用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 玄参的化学成分及作用靶点的预测

采用中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)[10]查询。关键词：玄参。限定条件：口服利用度(oral bioavailability，OB)>30%，类药性(drug-likeness，DL)>0.18[11-12]。在数据库中筛选出玄参的化学成分和对应靶点。通过蛋白质数据库(UniProt)将靶点的名称转换为简称，将物种设置为人，对靶点基因和蛋白信息进行校正，获得标准的Symbol名称。

1.2 获取糖尿病足-玄参靶点交集

通过人类基因综合数据库(GeneCards)和人类孟德尔遗传数据库(OMIM)查询疾病靶点，以“糖尿病足”“diabetic foot”为检索词搜索，将搜索结果合并、规范化、去重后，与1.1项下的结果取交集，获得玄参-糖尿病足靶点交集。

1.3 构建玄参成分-靶点-糖尿病足网络

通过Cytoscape 3.7软件中的网络分析功能，调节节点的颜色及度值(Degree)，获得玄参的主要化学成分以及相互作用网络图。

1.4 构建药物-疾病蛋白质-蛋白质相互作用网络

在String 11.0数据库中，限定物种为人，忽略孤立节点，选择结合分数>0.4的连接关系，导入1.2项下玄参-糖尿病足结果；得到玄参-糖尿病足靶点蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-Protein Interaction，PPI)网络，利用R语言软件(版本4.0.2)，分析PPI网络数据后做图。

1.5 GO富集分析及KEGG通路富集分析

采用DAVID 6.8数据库，导入玄参-糖尿病足交集基因，限定物种为人类，设定阈值P<0.05，进行GO功能富集分析及KEGG通路富集分析，再将结果导入基迪奥生物信息云平台(OmicShare)绘制通路信息图。

2 结 果

2.1 玄参化学成分及对应靶点的筛选结果

本研究以玄参为关键词，TCMSP为数据库，OB>30%、DL>0.18为搜索条件，共得到玄参化学成分9个；检索玄参的作用靶点，根据选出的化学成分筛选出对应的靶点，共得到靶点36个。

2.2 糖尿病足相关靶点及玄参-糖尿病足交集靶点

使用关键词“Diabetic foot”在GeneCards数据库和OMIM数据库中进行检索，分别得到糖尿病足的相关靶点4 553个和192个，去除重复靶点，共得到不重复靶点4 726个，与2.1项下结果取交集，得到玄参-糖尿病足交集靶点28个。

2.3 玄参-活性成分-靶点-糖尿病足网络及分析结果

将玄参的活性成分及交集靶点结果导入Cytoscape数据库，得到玄参-活性成分-靶点-糖尿病足网络，见图1。网络中，共有34个节点、69条边，蓝色圆形代表活性成分，绿色长方形代表靶点，边表示活性成分与靶标之间相互联系。活性成分中Degree值最高者为β-谷甾醇，接下来依次是柳杉酚、玄参苷，其他类型谷甾醇如γ-谷甾醇、α1-谷甾醇，其所对应的作用靶点分别为21，10，3，1个。由网络可知，玄参治疗糖尿病足是由多成分参与并作用于多个靶点的，非单一模式，其中β-谷甾醇可能是玄参治疗糖尿病足的关键成分。

2.4 构建PPI网络和筛选核心靶点

导入玄参-糖尿病足的交集靶点至STRING 11.0数据库，构建PPI网络，含有28个节点和84条边，表示有28个相关蛋白参与，以及84个蛋白之间的相互作用关系。将PPI网络数据导入Cytoscape数据库，依据蛋白的Degree值调节节点大小，Degree值越大，节点越大。见图2。由此可推测，玄参治疗糖尿病足可能与半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶3(Caspase 3,CASP3)、前列腺素内过氧化物合酶2(Prostagrandin-endoperoxid synthase 2,PTGS2)、乙酰胆碱酯酶(A cetylcholinesterase,AChE)、JUN原癌基因(Jun Proto-oncogene,JUN)、半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶9(Caspase 9,CASP9)这些节点有关。

图2 玄参-糖尿病足交集靶蛋白PPI网络图

2.5 GO和KEGG富集分析

利用David 6.8在线数据库对玄参治疗糖尿病足的有效作用靶点进行GO功能富集分析。以P<0.05为阈值进行筛选，结果见图3。GO富集分析包含3个部分：生物过程(Biological Process,BP)、分子功能(Molecular Function,MF)和细胞组分(Cellular component,CC)。确定了72项条目：其中BP部分45项，列出前20项；CC部分12项，列出前5项；MF部分15项，列出前5项。见表1。

图3 玄参有效成分对应靶标的KEGG通路富集分析结果图

表1 玄参-糖尿病足有效作用靶点GO富集分析结果

以P<0.05为阈值，共发现82条KEGG通路。根据P值由小到大的顺序，取排名前20的通路，采用Omicshare网站作图，进行可视化展示，见图4。其中信号传导、神经系统、内分泌系统、癌症、感染5大类的信号通路包含的基因最多，分别包含17，14，13，12，10个基因。具体涉及通路包括神经活性配体-受体相互作用通路、乙型肝炎、麻疹、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、EB病毒感染、1型人体免疫缺陷病毒感染、人巨细胞病毒感染、大肠癌、细胞凋亡、心肌细胞的肾上腺素信号传导、钙离子信号通路、凋亡-多种、铂耐药、p53信号通路、小细胞肺癌、唾液分泌、白细胞介素(IL)-17信号通路、晚期糖基化终末产物(AGE)-AGE受体(RAGE)信号通路、胆碱能突触、乳腺癌、雌激素信号通路、血清素能突触等，主要包括神经活性配体-受体相互作用通路、AGE-RAGE信号通路、Ca2+信号通路、雌激素信号通路、IL-17信号通路、p53信号通路等6个通路，说明玄参可通过影响多个通路治疗糖尿病足。

图4 玄参-糖尿病足KEGG富集前20条信号通路图

3 讨 论

玄参性微寒，味苦、甘、咸，归肺、胃、肾经，具有抗炎、抗菌、降血糖、抗肿瘤、解热镇痛等作用。《本草正义》曰：“玄参，禀至阴之性，专主热病，味苦则泄降下行，故能治脏腑热结等证。味又辛而微咸，故直走血分而通血瘀。亦能外行于经隧，而消散热结之痈肿。寒而不峻，润而不腻，性情与知、柏、生地近似，而较为和缓，流弊差轻。玄参赋禀阴寒，能退邪热，而究非滋益之品。”四妙勇安汤为治疗糖尿病足的代表方剂，其中玄参为该方的主要用药。虽然越来越多的研究证实了玄参对糖尿病足治疗的有效性[13]，但其治疗机制尚未明确。本研究基于网络药理学对玄参治疗糖尿病足的机制进行数据挖掘，研究结果发现：玄参治疗糖尿病足的主要化学成分为β-谷甾醇，接下来依次是柳杉酚、玄参苷、谷甾醇等。既往研究表明：β-谷甾醇属于植物甾醇，结构与胆固醇类似；在高脂饮食和蔗糖诱导的2型糖尿病大鼠中，β-谷甾醇可通过调节IRS-1/Akt信号通路，减弱脂肪组织中的胰岛素抵抗[14]。玄参苷具有在人体外周血单核细胞中诱导调节性T细胞的能力。研究表明:玄参苷可增加静息电位人体外周血单核细胞中Foxp3、转化生长因子-β和IL-10 mRNA的表达，有作为消炎药的巨大潜力[15]。目前，尚缺乏关于柳杉酚治疗糖尿病足的相关研究，这为今后的实验研究提供了新的方向。

玄参-糖尿病足PPI网络包括28个相关蛋白和84个蛋白之间的相互作用关系，其中主要靶点包括CASP3、DTGS2、AChE、JUN、CASP9等，这说明玄参治疗糖尿病足的机制是多成分、多靶点的。

玄参-糖尿病足KEGG通路富集分析结果发现了82条显著相关的通路。在所筛选出的通路中，信号传导、神经系统、内分泌系统、癌症、感染5大类的信号通路包含的基因最多，主要涉及神经活性配体-受体相互作用通路、钙离子信号通路、p53信号通路、IL-17信号通路、AGE-RAGE信号通路、雌激素信号通路。KHANAL P等[16]研究发现,神经活性配体-受体相互作用通路可作为调节糖尿病蛋白的主要通路，能够调节绝大部分降糖的蛋白。内皮细胞的胰岛素抵抗是造成胰岛素抵抗及2型糖尿病患者发生动脉粥样硬化和心血管疾病的主要原因，而下肢动脉粥样硬化造成肢体远端缺血、坏死、感染是糖尿病足的直接原因。研究表明：多种基因增强内皮细胞中的胰岛素敏感性都是依赖钙离子信号通路的，如细胞膜钙转运三磷酸腺苷酶1。p53是一种大小为53kD的蛋白质，首先在肿瘤的病毒研究中被发现，是目前发现的与人类肿瘤相关性最高的基因。TP53也是人类癌症中最常见的突变基因[17]。p53蛋白不但可以限制肿瘤发展，响应DNA损伤、缺氧、癌基因表达、营养剥夺及核糖体功能障碍等多种信号，而且可以控制多种生物反应过程，如组织重塑、自噬、ROS控制，以及代谢过程等[18-20]。IL-17是一种促炎性细胞因子，与多种自身免疫性疾病有关。对自身免疫性糖尿病动物模型和1型糖尿病患者的相关研究均提示，IL-17参与糖尿病的发病机制。IL-17可以增加炎症反应，加速氧化应激和细胞凋亡。减少IL-17，可以降低血糖，提高血清胰岛素。IL-17联合链脲霉素会增加对胰岛MIN6细胞的破坏[21]。研究[22]表明，阻断IL-17可以减轻糖尿病视网膜病变。糖尿病足是糖尿病的严重并发症之一，主要表现为足部的溃疡及创面难以愈合。AGE-RAGE信号通路是糖尿病足发生的一个重要环节。AGE是多种不同中间产物，是缩合、重排、裂解、氧化修饰等非酶促糖基化反应产物。正常人体内的AGE含量较低，但糖尿病患者体内AGE的生成会明显加速。AGE的蓄积是导致神经、血管等组织器官损伤的重要病理基础[23-24]。已有研究表明，雌激素受体存在β细胞中，雌激素可以影响胰岛β细胞中胰岛素的合成与分泌，同时影响β细胞的存活和胰岛素基因的表达。雌激素干预可以降低糖尿病小鼠的血糖水平，增加胰岛素分泌，增强胰岛素基因的表达[25]。

综上所述，玄参治疗糖尿病足的机制具有多成分、多靶点、多通路等特征，相较于西药单一作用机制更具有优势。玄参的主要治疗成分为β-谷甾醇，作用靶点包括CASP3、PTGS2、AChE、JUN、CASP9，核心通路涉及神经活性配体-受体相互作用通路、钙离子信号通路、p53信号通路、IL-17信号通路、AGE-RAGE信号通路、雌激素信号通路6个通路。采用网络药理学研究玄参治疗糖尿病足的机制仅是分子机制的预测，为进一步深入探讨其作用机制指明了方向，后期将在此研究基础上开展动物实验和临床研究来验证其作用机制。