烟草双生病毒RaMoV在烟粉虱中的检测

白建保,欧阳智刚,闻 刚,赖荣泉,王联德∗

(1.中国烟草总公司职工进修学院，河南郑州450008；2.赣南师范大学生命与环境科学学院，江西赣州341000；3.中国烟草总公司海南省公司，海南海口570000；4.福建农林大学植物保护学院，福建福州350002)

烟草双生病毒RaMoV在烟粉虱中的检测

白建保1,欧阳智刚2,闻 刚3,赖荣泉4,王联德4∗

(1.中国烟草总公司职工进修学院，河南郑州450008；2.赣南师范大学生命与环境科学学院，江西赣州341000；3.中国烟草总公司海南省公司，海南海口570000；4.福建农林大学植物保护学院，福建福州350002)

苎麻花叶病毒(Ramie mosaic virus,RaMoV)是常见由烟粉虱传播的双生病毒(Geminivirus)。用特异性引物进行PCR检测,结果发现,B型烟粉虱(Bemisia tabaci)能够在烟草上传播该双生病毒。

烟粉虱；烟草；双生病毒；苎麻花叶病毒；分子检测

烟草、苎麻均是南方常见的经济作物。苎麻花叶病毒(Ramie mosaic virus,RaMoV)是苎麻上的一种重要病害,在全国范围内都有不同程度的发生,一般可使原麻减产10%－60%。苎麻花叶病毒是由烟粉虱(Bemisia tabaci)传播的一种双生病毒(Geminivirus)(Li et al.,2010；Saunders et al.,2002；Wang et al.,2004)。由于双生病毒能够通过突变、重组、假重组快速变异,进化出新的病毒株系(Seal et al.,2006),新的病毒株系不断发生在其相邻作物上,如烟草、木瓜、辣椒等(Mansoor et al.,2003,2006),给农业生产造成极大的危害,因此,加强对这类病毒的研究十分必要。我们利用PCR技术,检测B型烟粉虱能否在烟草上传播苎麻花叶病毒,研究结果将为烟草病毒病的防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试植物:心叶烟(Nicotiana glutinosa)和普通烟(Nicotiana tabacum)K326品种均由福建农林大学植物保护学院植物病毒研究所提供。心叶烟和普通烟用于苎麻花叶病毒接种试验,普通烟用于烟粉虱传毒试验。

供试双生病毒:RaMoV、携带RaMoV DNA-A和RaMoV DNA-B全长基因侵染性克隆载体的农杆菌EHA105的毒源均由福建农林大学植物保护学院植物病毒研究所提供。

供试虫源:B型烟粉虱由福建农林大学植物保护学院昆虫学实验室温室饲养,饲养寄主植物以甘薯(Ipomoea batatas Lam)、黄瓜(Cucumis sativus L.)为主。

试剂:DNA聚合酶购自于TAKARA公司；核酸标准分子量(Lambda DNA EcoR I/HindⅢmarker)购自Fermentas公司。

1.2 方法

1.2.1 农杆菌接种 将含有RaMoV DNA-A和RaMoV DNA-B全长基因的侵染性克隆载体的农杆菌菌液等比例混匀,使用一支1 mL的一次性注射器,吸取混合的农杆菌菌液,分别在距离供试烟草根部1－2 cm处、叶柄处取三点进行植物韧皮部注射,接种烟草置于防虫室中培养,观察其发病症状。以发病的烟草作为毒源植物,进行传毒试验。

1.2.2 烟粉虱传播双生病毒 将健康烟粉虱成虫接于毒源寄主植物上,饲毒48 h作为带毒烟粉虱,后将带毒烟粉虱转接于健康普通烟和心叶烟上,平均每株供试烟草接30头带毒成虫,烟粉虱成虫释毒2 d后喷洒农药(吡虫啉,原液稀释1 000倍)以杀死烟粉虱。普通烟或心叶烟继续在防虫笼中生长,直至表现出症状。

1.2.3 烟草植株体内病毒DNA的检测 供试烟草注射农杆菌菌液接种30 d后,或烟粉虱传毒的烟草发病后,采集烟草叶片,提取烟草总DNA,按照杨彩霞(2009)方法,采用CTAB法提取烟草叶片总DNA,采用特异性引物进行PCR检测,引物见表1。

1.2.4 烟粉虱体内病毒DNA的检测 按照纠敏(2006)方法提取烟粉虱总DNA,提取后的DNA加入20 μL ddH2O溶解,放置－20℃保存备用。采用特异性引物进行PCR检测(表1)。

表1 检测所用PCR引物1)Table 1 PCR primers used for identification

2 结果与分析

2.1 农杆菌介导的RaMoV烟草侵染

试验表明,农杆菌介导的RaMoV DNA-A和DNA-B混合侵染,30 d后能在普通烟上引起矮化症状(图1A),而在心叶烟上产生典型的曲叶症状(图1B),并且接种发病的烟草体内均检测到RaMoV F3 DNA-A和DNA-B片段,其大小均为1 000 bp左右(图2A和2B)。

图1 RaMoV F3 DNA-A、DNA-B接种在普通烟(A)和心叶烟(B)上的结果Figure 1 Symptoms induced by RaMoV RaMoV F3 DNA-A、DNA-B on N.tabacum(A)and N.glutinosa(B)

图2 发病烟草RaMoV F3 DNA-A(A)和DNA-B(B)PCR检测结果Figure 2 Identification of RaMoV F3 DNA-A(A)and DNA-B(B)in infected tobaco by PCR

2.2 烟粉虱体内双生病毒的检测

烟粉虱体内分别扩增到了RaMoV DNA-A和DNA-B,其大小均为1 000 bp左右(图3)。

健康烟粉虱成虫接于农杆菌介导发病的烟草上饲毒2 d后,再转接于健康普通烟草上释毒。14 d后,普通烟顶端叶片出现轻微的卷缩症状(图4A),28 d后,烟草顶端所有叶片都卷缩起来。在发病的普通烟上分别检测到F3 DNA-A和F3 DNA-B,其大小均为1 000 bp左右(图4B)。

烟粉虱传毒后30 d,普通烟和心叶烟分别表现出症状(图5),心叶烟的叶背面已明显出现脉肿、耳突等症状(图5E和5F)。

图3 烟粉虱体内双生病毒的PCR检测结果Figure 3 Identification of geminivirus by PCR from infected B.tabaci

图4 传毒后30 d普通烟表现的症状(A)和F3 DNA-A、DNA-B的检测结果(B)Figure 4 Symptoms in N.tabacum after transmitted 30 d(A)and identification of F3 DNA-A、DNA-B by PCR(B)

图5 烟粉虱传毒后30 d普通烟和心叶烟的表现症状Figure 5 Symptoms of N.tabacum(A,B and C)and N.glutinosa(D,E and F)induced by F11 and F12 through 30 days after transmitted by whitefly

3 讨论

烟粉虱是多种双生病毒的传播介体。在本试验中,证明了B型烟粉虱能有效传播RaMoV。双生病毒不能经机械传播,因此烟粉虱在RaMoV病害的传播中起着重要作用,同时在B型烟粉虱体内均能检测到RaMoV,说明双生病毒能在烟粉虱体内越冬和越夏,这又为双生病毒病害的循环提供了初始病毒毒源。说明近年来,由RaMoV引起烟草、苎麻花叶病在我国迅速蔓延的原因与B型烟粉虱逐渐成为优势种群及高的带毒、传毒能力紧密相关。

致谢:试验中得到杨彩霞博士的帮助,谨此谢意。

纠敏,2006.烟粉虱、二种植物双生病毒(TYLCCNV、TbCSV)和寄主植物三者之间的互作[D].杭州:浙江大学.

杨彩霞,2009.福建省六种双生病毒的分子鉴定及RaMoV NSP互作蛋白的筛选[D].福州:福建农林大学.

Li J,Zhang X Y,Qian Y J,2010.Molecular characterization of Ramie mosaic virus isolates detected in Jiangsu and Zhejiang provinces,China[J].Acta Virologica,54(3):225-228.

Mansoor S,Briddon R W,Bull S E,et al,2003.Cotton leaf curl disease is associated with multiple monopartite begomoviruses supported by single DNA beta[J].Archives of Virology,148(10):1 969-1 986.

Mansoor S,Zafar Y,Briddon R W,2006.Geminivirus disease complexes:the threat is spreading[J].Trends in Plant Science,11(5):209-212.

Seal S E,Jeger M J,Bosch F V D,2006.Begomovirus evolution and disease management[J].Advances in Virus Research,67:297-316.

Saunders K,Bedford I D,Stanley J,2002.Adaptation from whitefly to leafhopper transmission of an autonomously replicating nanovirus-like DNA component associated with ageratum yellow vein disease[J].Journal of General Virology,83(4):907-913.

Wang X,Xie Y,Zhou X,2004.Molecular characterization of two distinct begomoviruses from Papaya in China[J].Virus Genes,29(3):303-309.

Molecular identification verify geminivirus RaMoV transmiting to tobacco vectored by Bemisia tabaci

BAI Jian-Bao1,OUYANG Zhi-Gang2,WEN Gang3,LAI Rong-Quan4,WANG Lian-De4∗
(1.College of Workers Continuing Education,China National Tobacco Corporation,Zhengzhou,Henan 450008,China；2.College of Life and Environmental Sciences,Gannan Normal University,Ganzhou,Jiangxi 341000,China；3.Hainan Provincial Company of China Tobacco Corporation,Haikou,Hainan 570000,China；4.College of Plant Protection,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou,Fujian 350002,China)

Ramie mosaic virus is a common geminivirus transmitted by Bemisia tabaci.Using the molecular identification by PCR with specific primer showed that the geminivirus could transmit to tobacco vectored by B.tabaci.

Bemisia tabaci； tabaco； Geminivirus； RaMoV； molecular identification

S432.4＋1

A

1001－4276－(2017)01－0069－05

白建保，欧阳智刚，闻刚，等，2017.烟草双生病毒RaMoV在烟粉虱中的检测[J].武夷科学，33:69-73.

2017－05－31。

福建省烟草公司科技项目(闽烟科2013[2]号)；2012年江西省农业科技推广专项。

白建保(1959－)，男，高级讲师。研究方向:烟草植保。Email:bjb598＠126.com。∗共同通讯作者欧阳智刚(1984－)，男，讲师。研究方向:植物病理。Email:oyfry＠163.com。王联德(1967－)，男，教授。研究方向:生物农药，生物防治。 Email:wang＿liande＠ 126.com。

(责任编辑:陈晓雯)