杭白菊中井冈霉素A的固相萃取

卢燕平,杨 广,吴加伦

(1.闽台作物有害生物生态防控国家重点实验室，福建农林大学应用生态研究所，福建福州350002；2.农业部植物病原及昆虫分子生物学重点实验室，浙江大学农药与环境毒理研究所，浙江杭州310058；3.害虫绿色防控福建省高等学校重点实验室，福建农林大学，福建福州350002；4.闽台作物有害生物生态防控协同创新中心，福建农林大学，福建福州350002；5.农业部闽台作物有害生物综合治理重点实验室，福建农林大学，福建福州350002)

杭白菊中井冈霉素A的固相萃取

卢燕平1,3,4,5,杨 广1,3,4,5,吴加伦2

(1.闽台作物有害生物生态防控国家重点实验室，福建农林大学应用生态研究所，福建福州350002；2.农业部植物病原及昆虫分子生物学重点实验室，浙江大学农药与环境毒理研究所，浙江杭州310058；3.害虫绿色防控福建省高等学校重点实验室，福建农林大学，福建福州350002；4.闽台作物有害生物生态防控协同创新中心，福建农林大学，福建福州350002；5.农业部闽台作物有害生物综合治理重点实验室，福建农林大学，福建福州350002)

建立杭白菊中井冈霉素A的固相萃取的方法。比较不同溶剂对目标农药的提取效率,其中采用甲醇－水(8∶2)提取时,井冈霉素A的平均回收率最好,平均回收率在89.53%－93.73%。比较不同萃取方式的净化效率,其中用C18-HLB串联小柱固相萃取井冈霉素A的回收率效果最好,为89.43%－92.60%。选择0.5 mL乙腈进行洗脱,发现第3次洗脱后回收率稳定,在90.05%－98.04%。用建立的方法对胎菊和朵菊样品进行添加回收率试验,杭白菊鲜样及干样中井冈霉素A的添加回收率在83.02%－89.93%之间,相对标准偏差(RSD)为0.57%－2.95%。

固相萃取；井冈霉素A；杭白菊

中国是中医药的发源地,是中药的生产和使用大国(汪佳凤等,2013)。杭白菊(Chrysanthemum morifolium)又称甘菊,为“浙八味”之一,是卫生部批准的首批药食同源的药材。杭白菊有大洋菊与小洋菊之分,具有散风清热、平肝明目、抗炎降压等功效,“杭白贡菊”一向与“龙井名茶”并提,古时曾作贡品(赵静等,2013)。杭白菊根据采摘期不同分为胎菊和朵菊两种,其在种植过程中易感染叶枯病、根腐病等病害,而井冈霉素是其常用的防治药物之一。

井冈霉素是吸水链霉菌井冈变种产生的水溶性农用抗生素(余晓江等,2011),属于氨基糖苷类化合物,共有6种结构(A－F),主要活性物质为井冈霉素A,一般产品中以井冈霉素A的含量来标示产品的规格及质量(杜良伟等,2012；Cao et al.,2011)。井冈霉素主要用于水稻纹枯病,也可用于水稻稻曲病、玉米大小斑病以及蔬菜和棉花、豆类等作物病害的防治,高效低毒且不易产生真菌抗药性,是我国独立发现并开发的一种农用抗生素(林志楷等,2013),在我国使用近40 a,目前已成为我国生产量最大的农用抗生素(朱永和等,2006)。出于保护人类健康和环境等原因(成卓敏,2005),2003年欧盟出台了有效霉素(井冈霉素)的禁用政策,引起我国有关部门的高度重视。

国内外关于井冈霉素A检测技术的研究很少,在中药材上的残留分析方法也未见报道。井冈霉素A分子中含多个极性基团,难于气化,不能直接用气相色谱分析(许鹏军等,2008)。已有的报道多用高效液相色谱法(余晓江等,2011；马婧玮等,2007)、柱前衍生化毛细管气相色谱法(许鹏军等,2008)和液相色谱－质谱法(关文碧等,2012)分析井冈霉素A,但主要集中在水稻及土壤样本上,已开发的方法难以应用于成分较复杂的中药材。为此,本文建立了杭白菊中井冈霉素A的残留分析方法,采用C18-HLB小柱联用净化,有效解决文献中使用单一萃取柱净化存在的杂质干扰大、分离效果差等问题,其样品检测的灵敏度较高,操作简便迅速,重现性好,为高效检测成分复杂中药材中的井冈霉素A提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

杭白菊胎菊及朵菊样品采自浙江桐乡市凤鸣街道杭白菊种植基地(未施过井冈霉素A),部分鲜样经加工后制成干样,用中药粉碎机粉碎,过20目(孔径900 μm)筛。

井冈霉素A标准品(纯度为91.8%,上海农药研究所),甲醇、乙腈为色谱纯(美国Dikma公司),磷酸氢二钠、磷酸为分析纯(国药集团化学试剂有限公司),超纯水(美国Millipore公司),助滤剂Celite545(硅藻土载体,国药集团化学试剂有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 色谱检测条件 色谱柱为TSKgel ODS-100V(250 gel OD,5 μm,迪马公司)；流动相为0.005 mol·L－1磷酸氢二钠缓冲液(磷酸调节 pH＝7) ∶甲醇＝95 ∶5；流速 1 mL·min－1；检测波长210 nm；进样量20 μL；柱温30℃。采用保留时间定性,外标法定量,井冈霉素A标准品的保留时间在7 min左右。

1.2.2 标准曲线制作 准确称取0.0109 g的井冈霉素A标准品于100 mL的容量瓶中,加超纯水配制成100 mg·L－1的标准贮备溶液。将标准储备液用超纯水稀释为10、5、1、0.5、0.1 mg·L－1的系列标准工作溶液,按1.2.1节进样,以质量浓度(x,mg·L－1)为横坐标,峰面积(y)为纵坐标绘制标准曲线。线性回归方程为:y＝15430x＋53.473,R2＝0.99998。井冈霉素A在质量浓度为0.1－10 mg·L－1之间具有良好的线性关系。

1.2.3 样品前处理 准确称取新鲜胎菊(朵菊)样品4 g,置于50 mL有盖样品瓶中,加25 mL甲醇－水(体积比8∶2)和1 g助滤剂,在匀浆机中高速匀浆1 min,超声提取30 min后布氏漏斗抽滤,10 mL甲醇分2次洗残渣,合并滤液于100 mL平底烧瓶中,60℃水浴减压浓缩近干,加2 mL甲醇制成待净化液,将2 mL待净化液过C18小柱净化,先用3 mL水,3 mL甲醇活化C18小柱,上样后用1 mL甲醇洗脱,收集洗脱液吹干加超纯水1 mL后过HLB小柱,先用3 mL甲醇,3 mL水活化HLB小柱,上样后再用1.5 mL乙腈洗脱,萃取完成后氮气吹干,用超纯水定容为2 mL,0.45 μm滤膜过滤,待测。

准确称取2 g干胎菊(干朵菊)样品加15 mL甲醇－水(体积比8∶2)提取,其他步骤同新鲜胎菊(朵菊)样品。

1.2.4 添加回收试验 选取不含井冈霉素A的胎菊和朵菊样品进行添加回收率测定,按照

1.2.3 和1.2.1步骤进行样品前处理和分析测定。胎菊及朵菊鲜样的添加水平分别为0.05、0.25、0.5 mg·kg－1,胎菊及朵菊干样的添加水平分别为 0.1、0.25、1.5 mg·kg－1,同时做空白对照,计算回收率和相对标准偏差(RSD)。

2 结果与分析

2.1 提取条件的选择

井冈霉素A是强极性化合物,易溶于水和甲醇。本研究比较了甲醇、水、甲醇－水3种溶剂对目标农药的提取效率,结果如表1所示。从表中可以看出,采用甲醇－水(8∶2)提取时,井冈霉素A的平均回收率最好,平均回收率在89.53%－93.73%,因此本研究选用甲醇－水(8∶2)作为提取溶剂对胎菊及朵菊中井冈霉素A进行提取。

表1 不同溶剂提取井冈霉素A的回收率(x±SE， n＝3)1)Table 1 Recovery rate of validamycin A with different extraction solvents

2.2 净化方法的优化

2.2.1 不同萃取方式的比较 样品中井冈霉素A的前处理最常用的是C18固相萃取小柱净化(许鹏军等,2008；马婧玮等,2007；关文碧等,2012；刘虹等,2007),但是C18固相萃取小柱主要吸附极性较低的物质,对于极性很强的井冈霉素A几乎不保留。因此,本研究比较了固相萃取(SPE)和液相萃取(LLE)对井冈霉素A的净化效率。SPE选用固相萃取小柱HLB、C18及C18-HLB串联小柱,LLE采用二氯甲烷和石油醚为萃取液,结果如表2所示。从表中可以看出,用C18-HLB串联小柱固相萃取对井冈霉素A的回收率最好,平均回收率在89.43%－92.60%,图1是其色谱分离效果。因此选择C18-HLB串联小柱对杭白菊样品中井冈霉素A进行富集和纯化。

表2 不同萃取方式对井冈霉素A回收率的影响(x±SE， n＝3)1)Table 2 Effect of different extraction methods on recovery rate of validamycin A

图1 杭白菊样品提取物色谱图Figure 1 Chromatogram of extraction from Chrysanthemum morifolium

2.2.2 洗脱液及其用量的选择 在HLB小柱之前串联C18小柱,样品中脂质、色素等杂质能够被去除(许鹏军等,2008；马婧玮等,2007；关文碧等,2012；刘虹等,2007),收集液再通过HLB小柱进一步纯化。井冈霉素A吸附在HLB小柱上,需用合适的洗脱液洗脱。采用乙腈洗脱时,获得的收集液含杂质较少,因此选择乙腈作为洗脱溶剂。用乙腈分6次洗脱,每次0.5 mL,分段收集洗脱剂测定回收率。由图2可知,第3次洗脱后回收率稳定,在90.05%－98.04%,因此确定洗脱剂的用量为1.5 mL。

图2 洗脱液不同用量对井冈霉素A回收率的影响Figure 2 Effect of different dosages of elution solution on recovery rate of validamycin A

2.3 添加回收率试验

对胎菊和朵菊样品进行添加回收率试验,结果如表3所示。在最优色谱条件下,检出限分别为0.05 mg·kg－1(胎菊及朵菊鲜样)、0.1 mg·kg－1(胎菊及朵菊干样)。杭白菊鲜样及干样中井冈霉素A的添加回收率在83.02%－89.93%,相对标准偏差(RSD)为0.57%－2.95%。

表3 井冈霉素A在杭白菊中的添加回收率(n＝3)Table 3 Fortified recovery rate of validamycin A in Chrysanthemum morifolium(n＝3)

3 讨论与结论

样品前处理是农药残留分析技术的关键,本试验对前处理条件进行优化。在选择提取溶剂时,甲醇提取出的杂质较多,干扰大。水作提取溶剂时,后续的抽虑及浓缩蒸干过程困难。为减少杂质对检测分析的干扰,简化操作,提高回收率,选择甲醇－水进行目标物的提取。在样品净化选择洗脱溶剂过程中,使用甲醇洗脱时,甲醇的极性大、洗脱性强,杂质的峰很高,影响色谱分离效果。水作为洗脱液时,回收率较低,且后续的浓缩困难。而用乙腈洗脱满足净化要求,因此选择乙腈作为洗脱溶剂。井冈霉素A在不同介质中的回收率不同,可能是因为胎菊及朵菊鲜样与干样中井冈霉素A的吸附性不同,进而导致回收率的差异(刘虹等,2007)。本方法的准确度和精密度均符合农药残留分析的要求,也可为检测其他产品中井冈霉素A的残留量提供参考。

成卓敏,2005.农业生物灾害预防与控制研究[M]∥张穗,温广月.井冈霉素研究进展与面临的挑战.北京:中国农业科技出版社:671-673.

杜良伟,徐秋红,王彦辉,2012.井冈霉素在水稻和土壤上残留及消解动态[J].农药,51(4):284-285.

关文碧,王晨,张红艳,2012.高效液相色谱——串联质谱法测定稻米和稻壳中井冈霉素A的残留[J].分析科学学报,28(1):136-138.

林志楷,刘黎卿,陈菲,2013.井冈霉素研究概况(综述)[J].亚热带植物科学,42(3):279-282.

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马婧玮,陈黎,蒋格平,等,2007.井冈霉素A的反相高效液相色谱分析[J].农药,46(10):686-687.

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Solid phase extraction of validamycin A from Chrysanthemum morifolium

LU Yan-Ping1,3,4,5,YANG Guang1,3,4,5,WU Jia-Lun2
(1.State Key Laboratory of Ecological Pest Control for Fujian and Taiwan Crops,Institute of Applied Ecology,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou,Fujian 350002,China；2.Ministry of Agriculture Key Laboratory of Molecular Biology of Crop Pathogens and Insects,Institute of Pesticide and Environmental Toxicology,Zhejiang University,Hangzhou,Zhejiang 310058,China；3.Key Laboratory of Green Control of Insect Pests(Fujian Agriculture and Forestry University),Fujian Province University,Fuzhou,Fujian 350002,China；4.Fujian-Taiwan Joint Centre for Ecological Control of Crop Pests,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou,Fujian 350002,China；5.Key Laboratory of Integrated Pest Management for Fujian-Taiwan Crops,Ministry of Agriculture,Fuzhou,Fujian 350002,China)

A method has been developed for the extraction and purification of validamycin A from Chrysanthemum morifolium.Validamycin A was extracted with the mixture of methyl alcohol and water(8∶2)with a better recovery rate of 89.53%－93.73%.Validamycin A was purified with C18-HLB and the recoveries were 89.43%－92.60%.Acetonitrile of 0.5 mL was used as the solvent for elution and after 3 times of elution the recovery rate reached the stable point of 90.05%－98.04%.Using the above method,the fortified recoveries of validamycin A were 83.02%－89.93%,with relative standard deviations(RSD)of 0.57%－2.95%.

solid phase extraction；validamycin A；Chrysanthemum morifolium

O657

A

1001－4276－(2017)01－0074－06

卢燕平，杨广，吴加伦，2017.杭白菊中井冈霉素A的固相萃取[J].武夷科学，33:74-79.

2017－09－29。

中加政府间科技合作专项“农业土壤治理与改良关键技术的联合研发”(2016YFE0102100)。

卢燕平(1988－)，女，助理实验师。研究方向:农药残留分析。Email:1010177685＠qq.com。

(责任编辑:陈晓雯)