黄曲霉毒素B1人工抗原的制备、鉴定与免疫特性研究

陈宇熹,方振霞,雷美玲,吴艺岚,张月珠,牛 蓉,叶 舟

(福建农林大学植物保护学院，福建福州350002)

黄曲霉毒素B1人工抗原的制备、鉴定与免疫特性研究

陈宇熹,方振霞,雷美玲,吴艺岚,张月珠,牛 蓉,叶 舟∗

(福建农林大学植物保护学院，福建福州350002)

采用EDC法制备获得黄曲霉毒素B1人工抗原AFB1-BSA。对AFB1-BSA紫外扫描,结果表明其图谱与黄曲霉毒素B1和BSA的图谱有明显差异,其红外扫描结果与BSA的图谱也有明显差异,表明BSA与黄曲霉毒素B1偶联成功。以不同摩尔比的AFB1-BSA人工抗原免疫小鼠,制备了特异性的鼠抗AFB1多克隆抗血清。综合评价不同起始摩尔比反应所得人工抗原的免疫特性和AFB1转化率,当AFB1与BSA的起始摩尔比为40∶1时,AFB1与BSA的偶联产物摩尔比为4.93∶1,AFB1的转化率达12.33%；用间接ELISA法测其抗血清的效价,经过四次免疫之后,抗血清的效价最高,高达1∶1 056 000。

黄曲霉毒素B1；人工抗原；抗体血清；ELISA

黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,简称AFB1)是由黄曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)产生的主要次级代谢产物之一,是目前所发现的一类强毒性,强致畸致癌性的真菌毒素(Ono et al.,2001；冯广鹏等,2007；黄向华等,2004；Busby et al.,1984；马健等,2012)。在世界不同地区,它对农作物、食品和饲料造成的广泛污染,已成为威胁人类以及动物健康的严重问题(Maria et al.,2000；Ponland et al.,1993；Brown et al.,1998；Charles et al.,2001)。进一步加强对黄曲霉毒素B1的检测,提高检测效率,有助于预防和控制早期中毒事件的爆发(Lu et al.,2008；Cullen,2008),对保障食品安全和人畜健康具有重要的意义。

目前AFB1毒素的检测有薄层层析法(马俊,2013)、高效液相色谱法(Sani et al.,2013)、免疫亲和柱层析法(谢芳等,2013)、ELISA法(Liu et al.,2013)、高灵敏度时间免疫分辨法(黄飚等,2006)等现代检测方法(李响等,2013)。AFB1检测试剂盒具有快速、简便、经济等优点,备受青睐,但对于这种试剂盒的市场化开发需要AFB1抗体作为原料。黄曲霉毒素B1的分子量为312.3,是只有反应原性而无免疫原性的小分子半抗原,不能通过刺激动物分泌抗体,只有和牛血清蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)、多聚氨基酸等载体蛋白连接成为大分子物质才能转化为具有免疫原性的完全抗原(Gathumbi et al.,2013)。提高AFB1人工抗原合成转化率,选择适宜的免疫途径,获得高效价AFB1抗体,成为AFB1检测试剂盒市场化开发的重要技术难题。关于AFB1人工抗原合成方法已有报道(王磊等,2011；孙亚宁等,2010；王光建等,1995；Chu et al.,1977；江湖等,2005)。本研究采用EDC法合成了AFB1-BSA人工抗原,AFB1得到了较高的转化率。用此不同摩尔比的人工抗原免疫小鼠,确立了适宜的免疫途径,对产生最大效价的抗体进行了研究。

1 材料与方法

1.1 试验材料

黄曲霉毒素B1、B2、G1标准品、阳离子化牛血清白蛋白(C-BSA)、羧甲氧基羟氨半盐酸盐(CMO)、碳二亚胺盐酸盐(EDC)、弗氏完全和非完全佐剂(Sigma公司)；羊抗鼠IgG∶HRP酶标二抗(北京索莱宝科技有限公司)；其他试剂均为分析纯。

BALB/c小白鼠,健康雌性,6周龄,购自上海斯莱克实验动物有限公司。

1.2 人工抗原的制备

1.2.1 AFB1肟的制备 参照江湖等(2005)方法,将2 mg AFB1与4 mg CMO溶解于400 μL吡啶中,25℃避光振摇反应24 h,取出微量进行TLC检测。将反应产物旋转蒸干,所得固体加入3 mL超纯水溶解,加入0.1 mol·L－1氢氧化钠溶液调pH值至8.0,分3次加入苯(4 mL、3 mL、3 mL)振荡萃取有机相中未肟化的AFB1。按照AFB1的标准曲线(配制浓度分别为100、50、25、12.5、6.25、3.125 μg·mL－1的 AFB1标准溶液,通过紫外扫描测定各浓度在特征吸收波长363 nm处的吸光度制作AFB1的标准曲线),计算AFB1的肟化率；在水相中滴加0.1 mol·L－1稀盐酸调至pH 3.0沉淀AFB1肟；用乙酸乙酯抽提沉淀物,旋转蒸干即得纯净的AFB1肟。

1.2.2 AFB1肟与C-BSA偶联物的制备 0.2 mg AFB1肟溶于100 μL DMF－水(6∶9,V/V)中,加入2 mg EDC避光混匀,再加入0.5%C-BSA溶液(BSA溶于0.13 mol·L－1的NaHCO3溶液)中,25℃避光100 r·min－1反应4 h,再补加EDC 2 mg继续反应至24 h,将偶联产物装入透析袋,4℃环境下,在0.01 mol·L－1PBS(pH 7.4)中透析3 d(24 h更换一次透析液)。

1.2.3 反应物起始摩尔比对偶联比的影响 参照陈福生等(1998)方法,取1 mg AFB1,按1.2.1的方法制备AFB1肟,得到的肟分成5等份,调整C-BSA溶液浓度使之与AFB1的摩尔比分别为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40及1∶50,按1.2.2中的方法制备AFB1肟与C-BSA的偶联物。用甲醇－PBS(1 ∶1,V/V)为溶剂分别配制0.023 mg·mL－1的AFB1和2 mg·mL－1的 C-BSA,偶联物也以甲醇－PBS(1∶1,V/V)为溶剂溶解,分别测定三种物质在AFB1特征吸收波长(363 nm)处的吸光度值和C-BSA特征吸收波长(278 nm)处的吸光度值,计算得到AFB1363 nm摩尔消光系数(KAam)为7 373,278 nm摩尔消光系数(KAbm)为1 937；BSA 363 nm摩尔消光系数(KBam)为2 529,278 nm摩尔消光系数(KBbm)为44 538。ACam为偶联物在363 nm处的吸光度值,ACbm为偶联物在278 nm处的吸光度值,A、B两物质摩尔比如下。

1.3 人工抗原的结构鉴定

1.3.1 紫外－可见扫描光谱法鉴定 分别取少量的AFB1、C-BSA以及它们的偶联产物,用甲醇－PBS(1∶1,V/V)配成溶液,在200－600 nm波长范围内进行紫外扫描,分析扫描图谱。

1.3.2 红外－可见扫描光谱法鉴定 分别取少量BSA标准品、AFB1-BSA偶联物与KBr混匀,在高压红外灯下烘干研磨制成溴化钾片,在傅立叶红外光谱仪上进行扫描,分析扫描图谱。

1.4 抗血清的制备

1.4.1 免疫方法 BALB/c小白鼠12只,分成5组,每组2只,同时设置阴性对照组2只。每只腹部皮下多点注射人工抗原100 μg·次－1,阴性对照组注射等体积的PBS溶液,间隔两周免疫一次；第一次免疫时,抗原与等体积的完全弗氏佐剂混合均匀,以后各次均和等体积的不完全弗氏佐剂混合,一共免疫5次。

1.4.2 抗血清的分离 免疫小鼠从每次免疫后的第14 d断尾取血,血样于室温下放置1－2 h,12 000 r·min－1离心10－15 min,取上层血清,测效价并分装,－20℃保存备用。

1.4.3 间接非竞争ELISA测抗血清效价 用0.1 mol·L－1pH 9.5的碳酸盐缓冲溶液稀释AFB1-BSA人工抗原至2.5 μg·mL－1,每孔100 μL包被96孔酶标板,4℃过夜,倾去包被液,PBST(含0.05%Tween-20,pH 7.2,0.1 mol·L－1磷酸盐缓冲溶液)满孔洗板三次,拍干；每孔200 μL 5%PBSM(5 g脱脂奶粉溶于100 mL PBS),37℃保温保湿2 h,倾去封闭液,PBST洗板三次,拍干；加入100 μL以PBSM倍比稀释的抗血清和阴性血清,同时用PBSM作为空白对照,37℃保温保湿2 h,PBST洗板三次,拍干；每孔加入100 μL的羊抗鼠IgG∶HRP酶标二抗(以PBSM作1∶2 000稀释),37℃保温保湿2 h,PBST洗板三次,拍干；每孔加100 μL反应底物(4 mg邻苯二胺加入10 mL底物缓冲液、10 μL H2O2,现配现用),37℃避光反应15 min,每孔50 μL 2mol·L－1H2SO4终止反应,5 min后以空白对照孔调零,490 nm处测吸光度。

1.4.4 抗血清特异性的鉴定 参照张小莺等(2011)方法,将AFB1-BSA人工抗原作适当稀释,与抗血清、昆明小鼠血清、健康家兔血清、BSA作双向琼脂扩散试验,同时用阴性血清作对照。

1.4.5 间接竞争ELISA法鉴定抗体灵敏度 2.5 μg·mL－1人工抗原AFB1-BSA包被酶标板,每孔100 μL,4℃过夜,倾去包被液,PBST洗涤拍干；5%PBSM封闭,每孔200 μL,37℃保温保湿 2 h,洗涤拍干。 配制 0、0.01、0.1、0.2、0.39、0.78、1.56、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200 ng·mL－1的AFB1标准溶液(20%甲醇－PBS溶解)。每孔依次加入AFB1标准溶液50 μL,抗血清(PBSM 稀释 4 000倍)50 μL,反应底物 100 μL,37℃避光反应 15 min,每孔 50μL 2 mol·L－1H2SO4终止反应,5 min后以空白对照孔调零,490 nm处测吸光度。按已优化的竞争反应条件绘制标准曲线,计算AFB1对抗原抗体结合反应抑制率在50%时的浓度(I50)及最低检测限(I10)。

1.4.6 间接竞争ELISA测抗血清与AFB2、AFG1的交叉反应情况 按照1.4.5分别配置AFB2、AFG1标准溶液代替AFB1标准溶液,其它步骤相同。

2 结果与分析

2.1 人工抗原的制备

2.1.1 AFB1肟的制备与AFB1转化率 当肟化反应进行至24 h,采用TLC法对肟化反应进行检测,用氯仿－甲醇(9∶1,V/V)进行展层。在其特征吸收波长363 nm紫外光激发下对产生的蓝色荧光进行分析,TLC展层结果(图1)显示,AFB1的Rf值为0.79,而AFB1肟的Rf值为0.28,AFB1肟在AFB1对应处没有荧光,表明反应进行完全。AFB1标准曲线方程:y＝0.0234x＋0.0085,R2＝0.9979；根据标准曲线计算AFB1转化率高达94.2%。

2.1.2 反应物起始摩尔比对偶联比的影响 起始反应物不同摩尔比所制备偶联产物中AFB1与C-BSA摩尔比,结果见表1。AFB1与C-BSA起始摩尔比的增加,偶联产物中AFB1与C-BSA摩尔比也相应提高,AFB1的转化率却逐渐降低。

图1 TLC法检测肟化产物Figure 1 The test of AFB1-Oxime by TLC

表1 偶联反应起始摩尔比对偶联产物摩尔比的影响Table 1 The influence of initial molar ratio on coupled production molar ratio

2.2 人工抗原的结构鉴定

2.2.1 人工抗原紫外－可见扫描光谱法分析 AFB1、C-BSA、AFB1-BSA人工抗原的紫外扫描光谱结果见图2。BSA是一种血清蛋白,在278 nm具有特征吸收峰,AFB1在363 nm处具有特征吸收峰。AFB1-BSA人工抗原同时具有AFB1和BSA两者明显的吸收峰,由于两者的叠加效应,AFB1-BSA人工抗原吸收峰的位置有轻微的位移,由此判定,AFB1和BSA偶联成功。

2.2.2 人工抗原红外结构分析 BSA、AFB1-BSA人工抗原的红外扫描结果见图3。BSA光谱显示,3 400 cm左右为胺基振动产生,1 651 cm酰胺谱带1,1 567 cm酰胺谱带2；AFB1-BSA的红外光谱显示,除具有BSA的特征谱带外,在1 100 cm附近具有AFB1肟结构中的C-O-C键吸收峰,偶联物在1 162 cm、1 077 cm显示出明显吸收峰。而1 760 cm处的香豆素环戍酮吸收峰、1 630 cm的C＝N特征峰由于受BSA吸收峰的影响表现并不明显,表明所得产品不再是AFB1,而是AFB1肟。结果表明AFB1肟与BSA偶联成功。

图2 AFB1、C-BSA及其偶联产物紫外扫描叠加图Figure 2 The UV scaning absorbance spectrum of AFB1、C-BSA and their coupled production

图3 BSA及AFB1-BSA偶联产物红外结构图谱Figure 3 The infrared structure spectrum of BSA and AFB1-BSA coupled production

2.3 抗血清的研究

2.3.1 免疫小鼠抗血清效价检测 采用间接非竞争ELISA测定小鼠抗血清效价,以阳性孔的吸光度值大于阴性孔的2.1倍的最高稀释倍数作为该抗体的效价。以免疫次数,不同比例的人工抗原,抗体效价为坐标轴,得到抗体效价三维变化柱形图(图4)。不同比例的人工抗原产生的抗体效价变化,结合AFB1-BSA人工抗原中AFB1的利用率,40∶1的人工抗原综合效果最佳,经过第四次免疫后,效价达到最大,为1 056 000,第五次开始降低。根据一般免疫规律,效价达到最大值之后就不会再升高而开始下降(王延华等,2005),因此不再增加免疫次数。

图4 小鼠免疫效价变化三维柱形图Figure 4 The three-dimensional column of mice immune titer

2.3.2 抗血清特异性的鉴定 双向琼脂扩散试验鉴定抗血清的特异性,结果如表2。抗血清与AFB1-BSA之间出现清晰的沉淀线,而与昆明小鼠血清、健康家兔血清、BSA、阴性小鼠血清之间未出现沉淀线,说明抗血清对AFB1具有特异性。

表2 抗血清特异性鉴定结果1)Table 2 The evaluation results of antiserum specificity

2.3.3 抗血清中抗体灵敏度的鉴定 通过间接竞争ELISA法测抗体的灵敏度,以AFB1浓度的对数值Lgx为横坐标,抑制率为纵坐标,绘制AFB1间接竞争抑制曲线(图5)。浓度在0.1－6.25 ng·mL－1和12.5－200 ng·mL－1时有较好的线性关系,得到的标准线性方程分别为:y＝27.446x＋42.4,R2＝0.9965,n＝7；y＝7.6903x＋73.164,R2＝0.9962,n＝5。 计算灵敏度 I50＝1.9 ng·mL－1,最低检测限 I10＝0.1 ng·mL－1。

2.3.4 抗血清的交叉反应 通过间接竞争ELISA法,以AFB2、AFG1作为竞争抗原,检测它们对小鼠抗血清的竞争抑制性,并测定AFB2、AFG1与AFB1之间的交叉反应率。结果表明,AFB2、AFG1的灵敏度 I50分别为 13.8 ng·mL－1,17.1 ng·mL－1。 AFB1对抗血清的竞争抑制性最强,记为100%,AFB2、AFG1的交叉反应率分别为:13.77%、11.11%。说明本试验制备的AFB1-BSA人工抗原具有很好的灵敏度。

图5 AFB1间接竞争ELISA抑制曲线Figure 5 The inhibitive curve of AFB1indirectly competing ELISA

3 小结与讨论

本研究采用EDC法制备了不同摩尔比的AFB1-BSA人工抗原,在制备AFB1肟时,江湖等(2005)前人采取冷冻干燥,由于吡啶的熔点比较低,对真空冷冻干燥机等设备的要求较高,本试验将反应产物备AFB1肟进行旋转蒸干,使试验更加可行。AFB1转化为AFB1肟的转化率高达94.2%,与江湖等(2005)、吴鑫茹等(2013)、魏继涛等(2012)研究相比,AFB1得到了高效率的利用。

研究几种不同摩尔比制备的人工抗原,不是摩尔比越高的人工抗原免疫效价越高,也不是AFB1转化率越高的人工抗原免疫效价越高,需同时将不同摩尔比制备的人工抗原经过一定的免疫程序进行综合比较,才能得到AFB1利用率高,效价高、特异性好的抗体,该评价方面目前尚未见相关报道。AFB1与BSA的起始反应摩尔比为40∶1,得到人工抗原中AFB1与BSA的偶联产物摩尔比为4.94∶1,经过四次免疫得到血清效价高达1 056 000,高于孙秀兰等(2007)、魏继涛(2012)的研究结果,确立了适宜的免疫途径。通过抗体灵敏度、特异性、交叉反应的鉴定结果可以看出,抗血清效价高、特异性好,说明免疫方法成功,自制的人工抗原具有较好的抗原性。

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Preparation and identification and immunological properties of Aflatoxin B1artificial antigen

CHEN Yu-Xi,FANG Zhen-Xia,LEI Mei-Lin,WU Yi-Lan,Zhang Yue-Zhu,NIU Rong,YE Zhou∗
(College of Plant Protection,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou,Fujian 350002,China)

Aflatoxin B1artificial antigen(AFB1-BSA)was prepared with EDC method.The results showed that the UV spectrum of AFB1-BSA was different from BSA and Aflatoxin B1obviously,and the IV spectrum was also different from BSA distinctly,all of which indicated that the preparation of AFB1-BSA was successful.BALB/c mice were immunized wth different molar ratio of AFB1-BSA artificial antigen,which made preparation of the specific polyclonal antiserum against AFB1.This paper comprehensively evaluated the immune characteristics of artificial antigens of different initial molar ratio and the utilization rate of AFB1.The artificial antigen was obtained with the molar ratio of 4.93∶1 and the AFB1utilization rate of 12.33%,when the initial molar ratio of Aflatoxin B1to C-BSA was 40∶1.BALB/c mice were immunized with AFB1-BSA for 4 times,and their titer antiserum from those mice were up to 1∶1 056 000 testified by indirect ELISA method.

aftatoxin B1；artificial antigen； antiserum；ELISA

TS201.3

A

1001－4276－(2017)01－0080－08

陈宇熹，方振霞，雷美玲，等，2017.黄曲霉毒素B1人工抗原的制备、鉴定与免疫特性研究[J].武夷科学，33:80-87.

2017－10－07。

福建省自然科学基金项目(2011J01077)；国家自然科学基金项目(31172297)；科技部农业科技成果转化资金项目(2011GB2C400012)。

陈宇熹(1984－)，女，助教。研究方向:生物农药。Email:liesleyu＠163.com。∗

叶舟(1957－)，男，教授。研究方向:天然产物化学研究。Email:yezhou1182＠126.com。

(责任编辑:陈晓雯)