复方黑面神软膏质量标准研究

萧俊祺　彭伟文　李圣鹏　董旺凤

（广州中医药大学附属中山市中医院，广东中山528400）

复方黑面神软膏质量标准研究

萧俊祺彭伟文李圣鹏董旺凤

（广州中医药大学附属中山市中医院，广东中山528400）

目的：提高复方黑面神软膏质量标准。方法：采用薄层色谱鉴别法对复方黑面神软膏成分中的当黑面神、苦参、蛇床子、白鲜皮、地肤子进行定性鉴别，用高效液相色谱法测定复方黑面神软膏中表儿茶素和苦参中苦参碱的含量。结果：在选定的薄层色谱条件下，色谱斑点清晰，分离效果好，无干扰；表儿茶素含量在0.008 4～0.033 6 g/L范围内呈良好的线性关系，r=1.000，测定的平均回收率为97.7%，RSD为1.4%（n=6）；苦参碱含量在0.014 7～0.058 8 g/L范围内呈良好的线性关系，r=0.999，测定的平均回收率为97.6%，RSD为1.5%（n=6）。结论：建立的定性、定量方法较简便、准确、灵敏、重现性好。

复方黑面神软膏；薄层色谱鉴别；高效液相色谱法

复方黑面神软膏由黑面神、苦参、蛇床子、白鲜皮和五味子5味中药组成，具有消炎止痒的功效，用于湿疹、荨麻疹、皮肤瘙痒、过敏性皮炎、漆过敏、阴道炎、外阴瘙痒、带状疱疹等的治疗。本研究的前期药理实验已证实，黑面神全株水提液具有显著的抗炎止痒作用［1］、免疫抑制作用、抗皮肤Ⅰ型超敏反应作用［2］，且黑面神全株水提物具有较好的体外抑菌作用，对小鼠慢性皮炎、湿疹具有很好的治疗作用，验证了其具有消炎止痒药效。广东的湿热天气适合各类病菌的生存繁衍，是多类皮肤病的高发区。然而，价格便宜、含中药有效成分的皮肤外用药种类仍较少。开发出安全有效、使用方便、价格便宜的中药制剂有着迫切的市场需求。因此对黑面神进行研究，既可以为黑面神属植物化学成分的分类奠定基础也可以为进一步研究开发黑面神奠定基础。若在已有基础上对黑面神进一步深入研究，有望开发出一种治疗皮肤病的外用新药。

1　材料与仪器

1.1仪器

Agilent 1100 series高效液相色谱仪；BS224S型电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司，d= 0.000 1 g）；jj200型电子天平（常熟市双杰测试仪厂）；电子JA-1203天平（上海天平仪器厂，d= 0.001 g）；DK-8D电热恒温三孔水槽（上海跃进医疗器械有限公司）；UV-2550型紫外-可见分光光度仪（日本岛津）；KQ3200E医用超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；HH-S4数显恒温水浴锅（金坛市医疗仪器厂）；RE-2000B型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；SHB-Ⅲ型循环水真空泵（巩义市英峪华中仪器厂）；东方-A型直热式电热恒温干燥箱（广州东方电热干燥设备厂）；Good see-Ⅰ薄层色谱摄影仪（上海科哲生化科技有限公司）。

1.2试药

黑面神枝叶购自广州至信药业有限公司，经广州中医药大学鉴定学教研室鉴定为大戟科黑面神属植物Breynia fruticosa（L.）Hook.f.的干燥嫩枝叶。表儿茶素对照品（批号：110878-200102），苦参碱对照品（批号：0805-9804），苦参对照药材（批号：121019-201407），蛇床子对照品（批号：110822-200305），蛇床子对照药药材（批号：121030-200405），白鲜皮对照药材（批号：978-9301），地肤子对照药材（批号：121148-200803）均为中国食品药品检定研究院提供。甲醇为色谱纯，水为屈臣氏蒸馏水，磷酸为分析纯。

2　方法与结果

2.1薄层色谱鉴别（TLC）

2.1.1黑面神［3］称取复方黑面神软膏5 g，加甲醇20 mL，放置1 h，滤过，滤液浓缩至5 mL，作为黑面神供试品溶液。另取黑面神对照药材同法制成对照药材溶液以及同法制成阴性样品溶液。再取表儿茶素对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的对照品溶液。吸取上述4种溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（1∶2∶0.2∶0.1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以25%磷钼酸乙醇溶液，在110℃加热至斑点显色清晰。供试品溶液在与对照药材和对照品色谱相应的位置上显相同颜色的荧光斑点，阴性样品无干扰。见图1。

图1　黑面神的TLC图

2.1.2苦参称取复方黑面神软膏5 g，加浓氨试液0.3 mL，三氯甲烷25 mL，加热回流30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL溶解，作为苦参供试品溶液；另取苦参对照药材同法制成对照药材溶液，再取与供试品相应量的苦参阴性样品，按供试品溶液的制备方法制成阴性样品溶液。最后取苦参对照品适量，加乙醇制成0.2 mg/mL的对照品溶液。照TLC（《中国药典》2010年一部附录ⅥB）试验，吸取上述溶液各4 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-乙醇-氨水（5.2∶0.7∶0.6）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以改良的碘化铋钾试液，热风吹干。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上显相同的橙色斑点。见图2。

图2　苦参的TLC图

2.1.3蛇床子［4］称取复方黑面神软膏3 g，加乙醇50 mL超声处理5 min，放置，取上清液作为供试品溶液，另取蛇床子对照药材4 g加水100 mL煮沸30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇5 mL同法制成对照药材溶液，再取与供试品相应量的蛇床子阴性样品，按供试品溶液的制备方法制成阴性对照品溶液，最后取蛇床子对照品溶液，加乙醇制成每1 mL含1 mg的对照品溶液。照TLC法（《中国药典》2010年版一部附录ⅥB）试验，吸取上述4种溶液各6 μL分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-正己烷（3∶3∶2）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰。见图3。

2.1.4白鲜皮［5］称取复方黑面神软膏4 g，加甲醇30 mL超声处理20 min，滤过，滤液加中性氧化铝（100～200目）1.5 g振摇2 min滤过，滤液置水浴上蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。取与供试品相应量的白鲜皮阴性样品，按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液，另取白鲜皮对照药材1 g加水40 mL煮沸并保持微沸30 min脱脂棉滤过，滤液置水浴上蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解作为对照药材溶液。取上述3种溶液各5 μL分别点于同一用0.5%氢氧化钠溶液制成的硅胶G薄层板上，以环己烷-丙酮-浓氨水（20∶20∶1）的上层液为展开剂，展开，取出，晾干，以10%的硫酸乙醇溶液显色，加热至斑点显色清晰，供试品色谱中在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰。见图4。

图3　蛇床子的TLC图

图4　白鲜皮的TLC图

2.1.5地肤子［6］称取复方黑面神软膏5 g，加乙醇40 mL，盐酸3 mL，加热回流2 h静置，倾出上清液，清液浓缩至约5 mL，加水20 mL，混匀，置分液漏斗中，加石油醚（60～90℃）振摇提取2次，每次约20 mL，合并醚液，蒸干，残渣加乙醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取地肤子对照药材2 g，同法制成对照药材溶液，再取与供试品相应量的地肤子阴性样品，按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。照TLC（《中国药典》2010年版1部附录ⅥB）试验，吸取上述3种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-醋酸乙酯-氯仿（20∶8∶5）为展开剂，取出，晾干，喷以磷钼酸试液，105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性无干扰。见图5。

图5　地肤子的TLC图

2.2含量测定

2.2.1色谱条件Boston Green ODS C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）流动相甲醇-0.1%磷酸溶液，梯度洗脱（程序见表1），流速1.0 mL/min。苦参碱检测波长220 nm，表儿茶素检测波长280 nm，柱温30℃，进样量20 μL。在此条件下供试品溶液中苦参碱和表儿茶素的峰与相邻峰能达到基线分离，其保留时间分别为10.056 min和48.333 min。理论塔板数按苦参碱峰计算应不低于4 000，表儿茶素峰应不低于3 600。

2.2.2溶液的制备

2.2.2.1对照品溶液的制备精密称取表儿茶素对照品8.4 mg，加50%甲醇制成每1 mL含0.84 mg的溶液，摇匀，即得；精密称取苦参碱对照品14.7 mg，加甲醇制成每1 mL含1.47 mg的溶液，摇匀，即得。

表1　梯度洗脱程序（%）

2.2.2.2供试品溶液的制备黑面神供试品溶液的制备：取本品约2 g，精密称定，用20 mL 50%甲醇溶解转移至25 mL容量瓶，超声20 min，50%甲醇定容，摇匀，过0.45 μm滤膜，取续滤液。苦参供试品溶液的制备：取本品约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入浓氨试液1 mL充分浸润膏体后，精密加入三氯甲烷20 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率140 W，频率42 kHz）30 min，放冷，离心，取上清液5 mL，减压回收至干，残渣用50%甲醇溶解转移至5 mL容量瓶中，用50%甲醇定容至刻度，摇匀，即得。

2.2.2.3阴性溶液的制备按照处方量制备不含黑面神的阴性样品和不含苦参的阴性样品，按照制备供试品的制备方法制备阴性对照溶液，即得。

2.2.2.4HPLC测定分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液20 μL注入液相色谱仪，测定峰面积，按外标法以峰面积计算表儿茶素和苦参碱的含量，色谱图见图6。阴性样品溶液在与对照品色谱峰相同保留时间处无色谱峰出现。

2.2.3含量测定的方法学考察

2.2.3.1标准曲线的制备分别精密吸取“2.2.2”中苦参碱和表儿茶素对照品溶液0.1，0.2，0.5，1.0，2.0，4.0 mL置5 mL量瓶中，苦参碱用甲醇稀释至刻度，表儿茶素用50%甲醇稀释至刻度，在“2.2.1”条件下进样分析。以进样浓度（g/L）为横坐标（X），以峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，回归方程分别为：

苦参碱：

图6　复方黑面神软膏HPLC图

Y=1 714.9X-3.835 5（r=0.999 9），

表儿茶素：

Y=13 346X+11.632（r=1.000 0）。

2.2.3.2精密度试验精密吸取同一浓度的对照品溶液，在“2.2.1”条件下进样6次，测得苦参碱和表儿茶素含量，结果显示RSD分别为0.57%和0.46%。表明实验仪器精密度良好。

2.2.3.3稳定性试验取同一份供试品溶液，在室温下放置0，2，4，8，12，24，48 h后分别进样，依法测定，结果见表2～3，软膏中表儿茶素的平均含量为1.444 mg/盒，RSD为1.1%（n=7）；软膏中苦参碱的平均含量为2.458 mg/盒，RSD为2.0%（n=7）。结果表明：供试品溶液在48 h内测定结果基本稳定。

表2　复方黑面神软膏中表儿茶素稳定性考察

表3　复方黑面神软膏中苦参碱稳定性考察

2.2.3.4重复性试验取同一复方软膏中的样品约5 g，精密称定，各6份，按正文“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，依法测定，结果见表4～5。复方黑面神软膏中表儿茶素的平均含量为1.433 mg/盒，RSD为2.5%（n=6）；软膏中苦参碱的平均含量为4.433 mg/盒，RSD为1.0%（n=6）。结果表明该方法有良好的重现性。

表4　复方黑面神软膏中表儿茶素重复性试验

表5　复方黑面神软膏中苦参碱重复性试验

2.2.3.5加样回收率试验取已知含量的同一软膏中的样品约5 g，精密称定，各6份，分两组，分别精密加入表儿茶素对照品溶液0.350 mg和苦参碱对照品溶液0.600 mg，按正文“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，依法测定，计算回收率，结果见表6～7。复方黑面神软膏中表儿茶素平均回收率为97.7%，RSD为1.4%（n=6）；复方黑面神软膏中苦参碱平均回收率为97.6%，RSD为1.5%（n=6）。结果表明表儿茶素和苦参碱的加样回收试验良好，符合定量分析要求。

2.2.3.6样品含量测定取复方黑面神软膏的样品3批，按正文“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，依法测定，计算供试品中表儿茶素和苦参碱的含量，结果见表8～9。

表6　复方黑面神软膏中表儿茶素回收率试验

表7　复方黑面神软膏中苦参碱回收率试验

表8　复方黑面神软膏中表儿茶素的含量测定

3　讨论

表9　复方黑面神软膏中苦参碱的含量测定

黑面神软膏中TLC法参考文献较少，实验难度较大。根据于健东等［7］TLC法鉴别儿茶中儿茶素和表儿茶素文献，用正丁醇-醋酸-水（3∶2∶1）为展开剂，5%硫酸乙醇溶液为显色剂105℃加热显色时，得到黑面神软膏中表儿茶素的薄层色谱斑点不清晰且拖尾严重。后用甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（70∶10∶20∶0.5）为展开剂，10%硫酸乙醇试液为显色剂时，发现展开距离太短，斑点模糊。经过多次试验摸索最终确定使用甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（70∶10∶30∶0.5）为展开剂，25%磷钼酸乙醇溶液为显色剂，在110℃加热显色，所得结果斑点清晰分离度好。

其余4味药参考文献较多，在参照相关文献并进行预实验后鉴别效果理想，苦参、蛇床子、白鲜皮、地肤子均获得很好的分离效果，薄层斑点清晰，且阴性无干扰。

在本次实验中，所建立的HPLC，操作流程比较简单，测量的结果比较准确且灵敏度较高，从而产品的质量可以得到稳定的控制，也为复方黑面神软膏的质量标准控制提供一定的依据。

［1］彭伟文，谭泳怡，梅全喜，等.黑面神水提物抗炎作用实验研究［J］.今日药学，2012，22（3）：145-147.

［2］彭伟文，戴卫波，梅全喜，等.黑面神水提物抗皮肤I型超敏反应的研究［J］.中国药房，2013，24（19）：1747-1748.

［3］袁建平，吕艳，黄兴富，等.金芥麦配方颗粒的质量标准［J］.中国药师，2012，15（5）：643-644.

［4］国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）［S］.北京：中国医药科技出版社，2010：296.

［5］王春桃，符洪.白山片的薄层色谱鉴别方法研究［J］.中国热带医学，2008，8（6）：1036-1037.

［6］林以慈，何昭斌，孙虹，等.归芍止痒颗粒质量标准研究［J］.中华中医药学刊，2014，32（9）：2182-2184.

［7］于健东，王钢力，高天兵，等.薄层色谱法鉴别儿茶中儿茶素和表儿茶素［J］.中国药师，2000，3（1）：3.

Study on Quality Standard for Compound Breynia Fruticosa Ointment

Xiao Junqi，Peng Weiwen，Li Shengpeng，Dong Wangfeng（Zhongshan Hospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated to Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangdong Zhongshan 528400，China）

Objective：To improve the quality standard for compound Breynia fruticosa ointment.Methods：The Breynia fruticosa，Sophora flavescens，Fructus cnidii，Cortex dictamni and Fructus kochiae scopariae in the ointment were qualitatively identified by thin layer chromatography（TLC），while the contents of L-Epicatechin in Breynia fruticosa and matrine in Sophora flaves cens were determined by high performance liquid chromatography（HPLC）.Results：Under the selected condition，the spots on TLC plates were clear without interference.The linear range of L-Epicatechin content was 0.008 4～0.033 6 g/L（r=1.000），while the mean recovery rate was 97.7%，with a RSD of 1.4%（n=6）.However，the linear range of matrine content was 0.014 7～0.058 8 g/L（r=0.999），while the mean recovery rate was 97.6%，with a RSD of 1.5%（n=6）.Conclusion：The developed methods for qualitative and quantitative determinations were simple，accurate，sensitive and reproducible.

Compound Breynia Fruticosa Ointment；Thin Layer Chromatography（TLC）；High Performance Liquid Chromatography（HPLC）

10.3969/j.issn.1672-5433.2015.12.004

2015-00-00）

广东省中山市科技局项目（20102A033）

萧俊祺，男，药师。研究方向：中药制剂开发。E-mail：602045059@qq.com

彭伟文，男，主任中药师，教授，硕士生导师。研究方向：中药制剂开发。通讯作者E-mail：pww200688@21cn.com