H PLC同时测定干蟾皮中华蟾酥毒基和酯蟾毒配基成分的含量

汪元符

（南昌市食品药品检验所，江西南昌330038）

H PLC同时测定干蟾皮中华蟾酥毒基和酯蟾毒配基成分的含量

汪元符

（南昌市食品药品检验所，江西南昌330038）

目的：建立干蟾皮中华蟾酥毒基和酯蟾毒配基2种化学成分含量测定的高效液相色谱法。方法：采用DIKMA C18色谱柱（250 mm×4.5 mm，5 μm），流动相为磷酸盐缓冲液（30 mmol/L磷酸二氢钾以磷酸调节pH值为3.0）及乙腈，梯度洗脱，柱温为35℃，流速为0.8 mL/min，进样量为10 μL，检测波长为296 nm。结果：2种化学成分检出限浓度均为1.0 μg/mL，定量限浓度均为2.5 μg/mL，线性范围为2.5～100.0 μg/mL，在线性范围内相关系数均在0.99以上，平均加样回收率为98.8%～99.9%。结论：本方法简便、准确、快速、重复性好、专属性高，可用于干蟾皮中华蟾酥毒基和酯蟾毒配基2种化学成分的含量测定。

高效液相色谱；干蟾皮；中华蟾酥毒基；酯蟾毒配基

干蟾皮至今未收载于历版《中国药典》，而见于《江苏省中药材标准（1989）》、《河南省中药材标准（1993）》、《江西省中药材标准（1996）》。干蟾皮为蟾蜍除去内脏的干燥全体。功能与主治：清热解毒，利水消肿；用于小儿疳积，咽喉肿痛，肿瘤；外治痈肿疔疮。以干蟾皮为原料药的中药单味制剂包括：华蟾素口服液、华蟾素注射液、华蟾素片、华蟾素胶囊等，用于恶性肿瘤晚期、乙型肝炎。以干蟾皮入药的中药成方制剂包括：大败毒胶囊（清热败毒，消肿止痛，用于梅毒及扁平疣）、鹤蟾片（解毒除痰，凉血祛瘀，消痰散结，用于原发性支气管肺癌，肺部转移癌）、季德胜蛇药片（清热解毒，消肿止痛，用于毒蛇、毒虫咬伤）等。可见干蟾皮是一味比较常用的、重要的动物类中药材。在现有的干蟾皮药品标准中，只收载了性状、水分（检查项），过于简单。本法建立干蟾皮中华蟾酥毒基和酯蟾毒配基2种化学成分含量测定的高效液相色谱法（HPLC），为干蟾皮的质量控制提供了参考。

1　仪器、试剂与材料

Waters e2695高效液相色谱仪，METTLER TOLEDOME204E电子分析天平，METTLERTOLEDO XS105电子分析天平，昆山KQ-300DB型数控超声波清洗器，Sartorius PB-10 pH计，TG16-WS台式高速离心机（湘仪离心机），Millipore超纯水系统。

甲醇（色谱纯，Merck），乙腈（色谱纯，Merck），磷酸（分析纯，Macklin），磷酸二氢钾（分析纯，Macklin）。

对照品：华蟾酥毒基对照品（110803-200605），酯蟾毒配基（110718-201108），均由中国食品药品检定研究院提供。

样品：干蟾皮10批次（批号：120406、120410、120412、120418、120610、120612、120614、121015、121016、121018），购自市场或流通企业，产地分别为江西、湖北、安徽、辽宁、山东、贵州、黑龙江、吉林。

2　方法与结果

2.1高效液相色谱分析条件

分析柱：DIKMA C18（250 mm×4.5 mm，5 μm）。柱温：35℃。流速：0.8 mL/min。进样量：10 μL。检测波长：296 nm。流动相：A为30 mmol/L磷酸二氢钾（以磷酸调节pH值为3.0），B为乙腈。按表1进行梯度洗脱。

2.2对照品溶液的配制

取华蟾酥毒基对照品、酯蟾毒配基对照品各约10 mg，精密称定，以甲醇制成每1 mL中各含1 mg的溶液作为对照品储备液。取对照品储备溶液以甲醇等比稀释，可得到各含2.5，5.0，10.0，20.0，30.0，40.0，50.0，60.0，70.0，80.0，90.0，100.0 μg/mL的标准系列溶液。

表1　梯度洗脱

2.3供试品溶液的配制

将10批样品分别研细，各取约2.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，称定质量，超声30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，以10 000 r/min离心10 min后，取上清液，用0.2 μm的滤头滤过，取续滤液测定。

2.4检测波长的确定及专属性试验

按“2.2”的方法配制对照品溶液，取各含50.0 μg/mL的混合对照品溶液试验。按“2.3”的方法制备供试品溶液、供试品加标溶液。分别取混合对照品溶液、试剂空白溶液、供试品溶液、供试品加标溶液，按“2.1”项下的条件检测。结果见图1～6。其中华蟾酥毒基对照峰保留时间为22.644 min，酯蟾毒配基对照峰保留时间为23.726 min。

由各成分的紫外吸收光谱图可知，华蟾酥毒基的最大吸收波长为294.0 nm，酯蟾毒配基的最大吸收波长为298.7 nm，选择检测波长为296 nm时，华蟾酥毒基、酯蟾毒配基都能得到较好的检测灵敏度。

由混合对照品溶液、试剂空白溶液、供试品溶液、供试品加标溶液所采集的色谱图比较可知，试剂空白及供试品对各成分的检测无干扰，各成分峰均能基线分离，分离度（R）均在2.0以上，实测理论塔板数均在4 000以上。

图1　试剂空白296 nm波长采集色谱图

图2　混合对照296 nm波长采集色谱图

图3　在22.644 min及23.726 min提取的华蟾酥毒基、酯蟾毒配基对照紫外吸收光谱图

图4　供试品296 nm波长采集色谱图

2.5线性关系及检出限、定量限考察

采用“2.1”项下的色谱条件，以“2.2”项下的标准系列溶液进样检测。以检测所得峰面积为纵坐标，以标准系列溶液浓度（μg/mL）为横坐标，进行线性拟合。以采集的色谱图中检出峰的信噪比大于3时的浓度（μg/mL）为检出限，信噪比大于10时的浓度（μg/mL）为定量限。以在一定浓度范围内，相关系数大于0.99，为线性范围。结果如表2。

图5　在22.778 min及23.842 min提取的华蟾酥毒基、酯蟾毒配基紫外吸收光谱图

图6　供试品加标296 nm波长采集色谱图

表2　2种成分标准曲线测定、检出限和定量限检测

2种成分在各自的线性范围内具有良好的线性关系，检出限均为1.0 μg/mL，定量限均为2.5 μg/mL，灵敏度较高。

2.6精密度试验

选用标准系列溶液中各成分浓度为50 μg/mL的标准溶液，连续进样6针，计算各成分峰面积的相对偏差。结果如表3，各成分RSD值在0.04%～0.05%之间，精密度良好。

2.7稳定性试验

选用标准系列溶液中各成分浓度为50 μg/mL的标准溶液，在0，2，4，8，12，24 h分别进样，以各成分峰面积计算。结果如表4，各成分RSD值在0.46%～1.06%之间，表明24 h内能稳定检测。

表3　2种成分精密度检测结果

表4　2种成分稳定性检测结果

2.8重复性试验

选用批号为120406的干蟾皮，按“2.3”项下的方法制备6份平行样品，按本法检测其中华蟾酥毒基、酯蟾毒配基的含量。结果如表5，各成分RSD值在0.15%～0.34%之间，表明重复性良好。

表5　2种成分重复性检测结果

2.9回收率试验

取批号为120406的干蟾皮（华蟾酥毒基0.134 7 mg/g，酯蟾毒配基0.087 4 mg/g）试验。准确称取1.00 g样品，按“2.3”项的方法制备供试液，2种成分理论浓度为：华蟾酥毒基2.69 μg/mL，酯蟾毒配基1.75 μg/mL。分别准确加入0.125，2.500，4.500 mL各含1 mg/mL的对照品储备液，再按“2.3”项的方法制备成供试液，2种成分理论加入浓度各为：2.5，50.0，90.0 μg/mL；加入后的理论加标浓度应为：华蟾酥毒基5.19，52.69，92.69 μg/mL，酯蟾毒配基4.25，51.75，91.75 μg/mL。以5次平行测定结果的均值与加标浓度相比较，回收率如表6所示，2种成分高、中、低3个浓度的回收率均在99.3%～99.7%之间。

表6　干蟾皮中加样回收试验

2.10样品测定结果

检测了10批干蟾皮，结果如表7所示。

3　讨论

3.1液相色谱条件的选择

参照《中国药典》2010年版一部“蟾酥”含量测定项下的色谱谱条件：以乙腈-0.5%磷酸二氢钾溶液（50∶50）（用磷酸调节pH值为3.2）为流动相，检测波长296 nm，柱温40℃。采集的混合对照品色谱图如图7所示。结果2种成分对照品峰不能分离，需要对液相色谱条件进行优化。

表7　干蟾皮中2种成分测定（mg/g）

试采用梯度洗脱的方式，结果2种成分对照品峰能够完全分离，而且能大大提高柱效（n＞4 500）。因此采用了本法梯度洗脱的方式。

图7　混合对照296 nm波长采集色谱图

流动相试用了磷酸盐缓冲液-乙腈、磷酸盐缓冲液-甲醇系统，结果以磷酸盐缓冲液-乙腈系统分离效率高，峰型好，柱效高。但高于50 mmol/L磷酸盐缓冲液浓度与乙腈混合，很有可能产生盐析，危害色谱系统，所以采用本法的30 mmol/L，以保护色谱系统。

流动相pH值的选择：所测的2种成分化合物在酸性条件下分离较好，试用了pH值为3.0，4.0，5.0等不同pH值的磷酸盐缓冲液，结果表明在pH值为3.0时，分离最好，柱效最高。

柱温的选择：在其他条件不变的前提下，试用不同的柱温：25，35，40℃。结果显示，柱温40℃时柱效反而不如柱温25℃。但柱温35℃与柱温25℃柱效相当。因此选用本法的条件，柱温35℃。

流动相流速的选择：考察了0.8 mL/min和1.0 mL/min两个流速下的色谱图。结果显示在0.8 mL/min流速下的柱效及分离优于1.0 mL/min的流速。因此选用本法的条件，流速0.8 mL/min。

3.2供试品提取方法选择

曾试用不同提取溶剂：甲醇、50%甲醇、乙腈、50%乙腈、乙醇、50%乙醇。结合不同提取方式：超声、索氏回流。结果表明，甲醇提取效率最高，且超声与索氏回流无明显差异，可以选用甲醇超声提取的方式。

考察了不同的超声时间：15，20，30，45 min。结果表明15 min提取不够完全，20，30，45 min提取时间的提取结果没有明显差异。因此，本法选用了30 min的提取时间。

以取样量2.0 g，考察了不同提取溶剂体积：10，25，50 mL对提取结果的影响。结果表明10 mL甲醇提取不够完全，25，50 mL甲醇提取结果没有明显差异。因此，本法选用了50 mL甲醇的提取体积。

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Simultaneous Determination of Cinobufagin and Resibufogenin in Dried Toad Skin by HPLC

Wang Yuanfu
（Nanchang Institute for Food and Drug Control，Jiangxi Nanchang 330038，China）

ABSTRACRObjective：To develop a HPLC method for determination of two components，cinobufagin and resibufogenin，in dried toad skin.Methods：DIKMA C18column（250 mm×4.5 mm，5 μm）was used，with phosphate buffer solution（30 mmol/L potassium dihydrogen，of which the pH value was adjusted to 3.0 with phosphoric acid）-acetonitrile as a mobile phase for gradient elution at a column temperature of 35℃and a flow rate of 0.8 mL/min.The sample loading was 10 μL，and the detection wavelength was 296 nm.Results：Both the detection limits of the two components were 1.0 μg/mL，while the quantitative detection limits were 2.5 μg/mL，the linear ranges were 2.5～100 μg/mL（r＞0.99），and the recovery rates were 98.8%～99.9%.Conclusion：The HPLC method is simple，accurate，rapid，and of a good reproducibility and a high specificity，which may be used for simultaneous determination of cinobufagin and resibufogenin in toad skin.

High Performance Liquid Chromatography（HPLC）；Dried Toad Skin；Cinobufagin；Resibufogenin

10.3969/j.issn.1672-5433.2015.12.005

2015-08-09）

汪元符，男，主管药师。研究方向：中药理论、药物检测及食品安全。E-mail：wanngel@126.com