阳春砂仁和化橘红对小鼠肝脏CY P3A及肠道首过效应的影响

王永辉　奇锦峰　林梅　孔永红

（1驻马店市中心医院药剂科，河南驻马店463000；2广州中医药大学中药学院，广东广州510006）

阳春砂仁和化橘红对小鼠肝脏CY P3A及肠道首过效应的影响

王永辉1奇锦峰2林梅2孔永红1

（1驻马店市中心医院药剂科，河南驻马店463000；2广州中医药大学中药学院，广东广州510006）

目的：研究阳春砂仁和化橘红对小鼠肝脏CYP3A以及肠道首过效应的影响，以指导临床精细用药。方法：将小鼠分为纯水对照组（10 mL/kg），酮康唑（1.8 mg/kg）、阳春砂仁和化橘红高、低剂量组（30 mL/kg和10 mL/kg）。灌胃给药2次/d，连续3 d。以分光光度法测定血中对乙酰氨基酚浓度；用超速离心法分离小鼠肝微粒体；分光光度法检测微粒体中CYP3A活性。结果：以红霉素和氨基比林为底物测定肝脏CYP3A活性时，阳春砂仁和化橘红高、低剂量组与纯水对照组之间均无显著性差异（P＞0.05）；血中APAP浓度测定结果显示，阳春砂仁和化橘红高、低剂量组显著高于纯水对照组（P＜0.01或P＜0.05）；P-gp偶联的ATP酶活性测定结果显示，阳春砂仁和化橘红高、低剂量组明显低于纯水对照组（P＜0.01或P＜0.05）。结论：阳春砂仁和化橘红对小鼠肝脏CYP3A的活性均没有抑制或诱导作用，对小鼠肠道P-gp活性具有不同程度的抑制作用。

CYP3A；P-糖蛋白；阳春砂仁；化橘红

药物相互作用（drug-drug interaction，DDI）是合理用药当中非常重要的研究领域之一，DDI有很大一部分原因与人体中的药物代谢酶或转运体有关。其中，CYP3A4是P450酶系中最重要的成员之一，约占肝脏P450含量的30%，能够代谢50%以上结构各异、性质不同的临床药物［1］；P-糖蛋白是由ABCB1基因编码的ATP结合转运蛋白，在许多化合物的转运过程中起着至关重要的作用［2］。有研究报告称，葡萄柚通过抑制肠道CYP3A活性能显著增加非洛地平的口服生物利用度，从而引起严重的副反应［3］。因此，服药期间的病人，尤其是慢性病患者更应该重视药物之间的相互作用。阳春砂仁和化橘红均属常用的岭南道地药材，化橘红具有理气化痰和健胃消食的功效，阳春砂仁具有行气调味、健脾和胃之功效，是治疗饮食积滞方面最为常用的两种药物［4-5］。基于以上原因，本研究初探了阳春砂仁和化橘红对小鼠肝脏CYP3A和肠道P-gp活性的影响，为临床精细用药提供参考。

1　实验材料

1.1动物

NIH小鼠（SPF级），雌雄各半，体重18～26 g（广州中医药大学实验动物中心，动物合格证号SCXK（粤2008-0020），粤监证号2008A003）。饲养环境温度为18～26℃，相对湿度为30%～70%，实验动物均以鼠专用饲料喂养。

1.2药品与试剂

阳春砂仁（广州采芝林药店，经鉴定为姜科植物Amomum villosum lour.的果实），化橘红（广州采芝林药业连锁店，经鉴定为芸香科植物Citrus grandis（L.）Osbeck的干燥果皮），分别用纯水将50 g药材煎至200 mL；NADPH（上海杰美基因医药科技有限公司，批号：5-81085H-12）；Bradford Protein ASSAY KIT（上海杰美基因医药科技有限公司，批号：6-3361211-10）；对乙酰氨基酚（Acetaminophen，APAP，Sigma Chemical，批号：107H0332）；超微量ATPase测定试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20100914）；Na3VO4（上海晶纯试剂有限公司，批号：19751）；酮康唑（南京白敬宇制药有限责任公司，批号：090102）；其他试剂均为分析纯等级。

1.3仪器

高速冷冻离心机（Thermo Electron Corporation，Heaeus Biofuge stratos）；G7-953T型组织匀浆机（As One，HOM，Japan）；恒温水浴摇床（SWB-2000型，天津奥特塞恩斯仪器有限公司）；T6新世纪型紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；手动连续分液器（Eppendorf Multipette plus，German）。

2　实验方法

2.1分组与给药

将60只小鼠随机分为6组，雌雄各半。分别为纯水对照组（10 mL/kg），酮康唑（1.8 mg/kg）、砂仁高、低剂量组（30 mL/kg，10 mL/kg），化橘红高、低剂量组（30 mL/kg，10 mL/kg）。灌胃给药2次/d，连续灌服3 d。最后一次给药1 h后，所有动物灌胃给予APAP（25 mg/kg）水溶液10 mL/kg。APAP给药1 h后小鼠断头取血于干燥离心管中，然后在低温下迅速打开腹腔取出小鼠肝脏和小肠，封装编号后储存于-80℃冰箱备用。血液静置30 min后离心（2 000×g，5 min），取上清液于1.5 mL离心管中，置-80℃冰箱中保存至测定。

2.2小鼠血中APAP浓度的测定

小鼠血清APAP浓度测定方法依据文献进行［6］，精密吸取血清0.25 mL，加入10%三氯醋酸1 mL，混匀后离心（10 000×g，5 min）。精密吸取上清液1 mL，加入6 mol/L盐酸和20%NaNO2溶液各0.25 mL，混匀后静置5 min使反应完全。缓慢加入15%的氨基磺酸溶液0.5 mL，振摇至无气泡产生。最后加入10%NaOH溶液1 mL，摇匀放置30 min。以不加APAP的上述混合液作为对照液调零，于430 nm波长处测定吸光度。APAP标准曲线为：

Y=0.007 5 X+0.002 4（r=0.999 9）。

浓度范围在0.5～50 μg/mL时，日内精密度为1.45%～2.02%；日间精密度为2.80%～3.64%；重现性为97%～106%。

2.3P-gp偶联的ATP酶活性测定

准确称取小肠后，按质量体积比（1∶9）加入一定量的生理盐水，经组织匀浆机迅速研磨后制成10%的肠匀浆。用生理盐水将制备好的肠匀浆稀释至原来的41倍，用于测定蛋白含量和肠组织中ATPase活性。实验根据P-gp在转运底物的同时伴随ATP的水解，通过检测ATP水解产生的无机磷的量来检测P-gp对底物的转运能力。实验通过在P-gp偶联的ATP酶抑制剂Na3VO4（vanadate）存在和不存在情况下，以供试物诱导无机磷生成量之差来衡量供试物对P-gp依赖性的ATPase的激活能力［7］，具体操作按超微量ATP酶试剂盒说明书进行。

2.4肝微粒体的制备

小鼠肝微粒体的分离主要依据文献进行［8］。在低温环境下迅速取出肝脏，加入适量的磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4），用组织匀浆器将其研磨成匀浆（920 rpm，30 s）。上述匀浆液离心（9 000×g，0℃）10 min后取上清液，加入100 mmol/L CaCl2溶液适量，然后离心（50 000×g，0℃）30 min后弃上清液，加入适量PBS重新混悬，最后再离心（50 000×g，0℃）30 min后弃上清液，所得沉淀物即为肝微粒体，加入PBS重新混悬并分装后，于-80℃贮存备用。微粒体中的蛋白含量采用Bradford法，以小牛血清标准蛋白作参照，按照试剂盒说明书定量。

2.5肝微粒体中CYP3A的活性测定

小鼠肝微粒体氨基比林-N-脱甲基酶活性的测定参照文献方法［9］进行，分别吸取待测微粒体0.02 mol/L Hepes缓冲液0.5 mL，20 mmol/L氨基比林0.4 mL或0.4 mmol/L红霉素0.1 mL于同一反应管混匀；37℃水浴3 min后加入0.1 mol/L NADPH 0.01 mL，37℃水浴30 min后加入12.5%三氯乙酸1.5 mL终止反应，离心（20 000×g，0℃）10 min后取上清液1 mL，加入Nash试剂1 mL于60℃水浴10 min，以不加微粒体的上述反应体系为对照，在412 nm处测定OD值。依据甲醛标准曲线计算酶活性，其单位以nmol/mg· protein·min表示。甲醛回归方程为：

Y=0.005 8X-0.043 1（r=0.994 0）。

2.6数据统计分析

3　实验结果

3.1小鼠肠道P-gp活性测定结果

实验结果如表1所示，砂仁高剂量组（30 mL/kg）小鼠血中APAP浓度均显著低于纯水对照组（P＜0.05）；化橘红高剂量组（30 mL/kg）和低剂量组（10 mL/kg）小鼠血中APAP浓度也显著低于纯水对照组，且这种作用具有剂量依赖性。由此说明它具有明显增强P-gp对底物APAP的肠道外排作用，进而降低APAP的血药浓度。

3.2小鼠肠道中P-gp偶联的ATP酶活性测定

实验结果如表1所示，砂仁高剂量组（30 mL/kg）和低剂量组（10 mL/kg）小鼠肠道中P-gp偶联的ATP酶活性显著低于对照组（P＜0.01）；化橘红高剂量组（30 mL/kg）和低剂量组（10 mL/kg）小鼠肠道中P-gp关联的ATP酶活性显著低于对照组（P＜0.05或P＜0.01），且具有剂量依赖性。

3.3小鼠肝微粒体中CYP3A活性测定

实验结果如表2所示，以红霉素和氨基比林为底物测定CYP3A活性时，砂仁和化橘红高（30 mL/kg）剂量组和低剂量组（10 mL/kg）小鼠肝脏中CYP3A活性与纯水对照组之间不具有显著性差异（P＞0.05）。

4　分析讨论

细胞色素P450系统的抑制或诱导是代谢性药物相互作用产生的重要因素，CYP3A4是人体CYP450酶系中最重要的成员之一，主要分布于人体的肝脏和肠道［10］，其生理功能对应于小鼠体内的是CYP3A11［11］。本研究显示阳春砂仁和化橘红高、低剂量组对小鼠肝脏CYP3A均没有抑制或诱导效应。

表1　小鼠肠道P-gp活性和P-gp偶联的ATP酶活性测定结果（±s，n=10）

表1　小鼠肠道P-gp活性和P-gp偶联的ATP酶活性测定结果（±s，n=10）

组别A P A P血药浓度（μ g / m L）P P纯水组2 . 4 5 ± 0 . 2 0酮康唑组4 . 0 2 ± 0 . 5 8 0 . 0 3 7阳春砂仁高剂量组3 . 3 0 ± 0 . 2 5 0 . 0 3 5阳春砂仁低剂量组4 . 0 1 ± 0 . 2 8 0 . 0 0 5化橘红高剂量组3 . 2 4 ± 0 . 2 5 0 . 0 4 4化橘红低剂量组3 . 1 3 ± 0 . 1 7 0 . 0 4 8 P -g p偶联的A T P酶活性n m o l / m g · p r o t e i n · h 7 7 . 5 3 ± 2 . 7 2 4 8 . 8 1 ± 5 . 8 1 3 1 . 0 9 ± 4 . 1 2 3 7 . 5 9 ± 3 . 4 9 5 5 . 8 8 ± 6 . 9 6 6 0 . 0 1 ± 5 . 4 3 0 . 0 0 3 0 . 0 0 1 0 . 0 0 1 0 . 0 2 0 0 . 0 2 7

表2　小鼠肝脏CYP3A活性测定结果（±s，n=10）

表2　小鼠肝脏CYP3A活性测定结果（±s，n=10）

肝脏C Y P 3 A活性n m o l / m g · p r o t e i n · m i n氨基比林P纯水组1 . 8 7 ± 0 . 2 7酮康唑组1 . 1 3 ± 0 . 0 5 0 . 0 4 6阳春砂仁高剂量组1 . 4 8 ± 0 . 1 5 0 . 1 5 0阳春砂仁低剂量组1 . 8 0 ± 0 . 5 0 0 . 4 9 5化橘红高剂量组1 . 7 8 ± 0 . 4 8 0 . 4 8 3化橘红低剂量组1 . 9 9 ± 0 . 2 3 0 . 7 9 6组别红霉素1 . 7 7 ± 0 . 2 4 1 . 1 6 ± 0 . 0 3 1 . 7 1 ± 0 . 0 6 1 . 9 4 ± 0 . 1 5 1 . 5 9 ± 0 . 2 2 1 . 7 5 ± 0 . 3 4 P 0 . 0 3 0 0 . 7 9 7 0 . 5 5 9 0 . 5 9 7 0 . 9 5 6

近年来，关于P-gp的测定方法多种多样，本研究用酮康唑作为CYP3A及P-gp的抑制剂，以APAP口服给药后60 min作为比较血药浓度的共同参考点，与Choo等［12］比较AUC的方法类似。同时本研究通过测定P-gp偶联的ATP酶活性来进一步研究药物与P-gp之间的相互关系，更为深入可靠。大量研究表明，决定口服药物生物利用度的主要因素是肠道细胞CYP3A对已吸收药物的生物转化作用和肠道细胞中P-gp对已吸收药物的主动外排作用［13］，因此测定阳春砂仁和化橘红对P-gp活性的影响显得相当必要。

P-gp是ATPase依赖性的药物转运体，许多P-gp的底物或调控体已被证明能够抑制或诱导P-gp偶联的ATPase活性［14］。当供试物在一定浓度范围内能抑制或诱导P-gp偶联的ATPase活性时，可初步认定该供试物能直接与P-gp相互作用［15］。本研究通过比较各给药组小鼠体内探针药物APAP的浓度，得出阳春砂仁和化橘红均能在一定程度上抑制P-gp的转运功能，同时阳春砂仁和化橘红还能抑制P-gp偶联的ATPase活性，由此表明这两种药物可能与黄酮类物质水飞蓟素类似［14］，通过结合P-gp上的ATP酶结合位点来抑制ATP的能量供应，进而降低P-gp的转运功能。其中化橘红对P-gp转运功能和偶联ATP酶活性的抑制作用具有剂量依赖性；阳春砂仁高、低剂量组对P-gp偶联ATP酶活性的抑制作用具有剂量依赖性，对P-gp转运功能的抑制作用没有剂量相关性。

阳春砂主要含黄酮类成分和挥发油（乙酸龙脑酯、樟脑、樟烯、柠檬烯等）。化橘红主要含有挥发油、柚皮苷、黄酮类物质和多糖等。本研究仅对两种中药的水提物进行研究，但由于中药成分复杂，目前还不能明确其中所含的每种单体成分在体内的代谢途径以及它们对CYP3A4和P-gp功能活性的影响。由于中药方剂的整体作用，当这两种中药共煎时是否对P-gp转运功能协同产生抑制效应还要受到方剂中其他药物的影响。另外，本研究的实验对象为小鼠，其结果与人体试验结果是否一致还未可知。因此，今后还将更为深入细致地进行人体试验方面的临床研究。

［1］Smith RP，Eckalbar WL，Morrissey KM，et al.Genome-wide discovery of drug-dependent human liver regulatory elements［J］. PLoS Genet，2014，10（10）：e1004648.

［2］Lee SH，Kim JS，Ravichandran K，et al.P-Glycoprotein Induction Ameliorates Colistin Induced Nephrotoxicity in Cultured Human Proximal Tubular Cells［J］.PLoS One，2015，10（8）：e0136075.

［3］Uesawa Y，Takeuchi T，Mohri K.Integrated analysis on the physicochemical properties of dihydropyridine calcium channel blockers in grapefruit juice interactions［J］.Curr Pharm Biotechnol，2012，13（9）：1705-1717.

［4］廖弈秋，李泮霖，廖文波.南药化橘红基原考证［J］.中药材，2015，2（1）：401-404.

［5］张凤玉.砂仁治疗功能性消化不良的临床价值探讨［J］.临床合理用药杂志，2014，7（4）：124-125.

［6］Shihana F，Dissanayake D，Dargan P，et al.A modified low-cost colorimetric method for paracetamol（acetaminophen）measurement in plasma［J］.Clin Toxicol，2010，48（1）：42-46.

［7］Xia CQ，Milton MN，Gan LS.Evaluation of drug-transporter interactions using in vitro and in vivo models［J］.Curr Drug Metab，2007，8（4）：341-363.

［8］Yanagiba Y，Ito Y，Kamijima M，et al.Octachlorostyrene induces cytochrome P450，UDP-glucuronosyltransferase and sulfotransferase via the aryl hydrocarbon receptor and constitutive androstane receptor［J］.Toxicol Sci，2009，111（1）：19-26.

［9］Bray BJ，Goodin MG，Inder RE，et al.The effect of retinol on hepatic and renal drug-metabolising enzymes［J］.Food Chem Toxicol，2001，39（1）：1-9.

［10］Plant N.The human cytochrome P450 sub-family：transcriptional regulation inter-individual variation and interaction networks［J］.Biochim Biophys Acta，2007，1770（3）：478-488.

［11］Hart SN，Cui Y，Klaassen CD，et al.Three patterns of cytochrome P450 gene expression during liver maturation in mice［J］.Drug Metab Dispos，2009，37（1）：116-121.

［12］Choo EF，Leake B，Wandel C，et al.Pharmacological inhibition of P-glycoprotein transport enhances the distribution of HIV-1 protease inhibitors into brain and testes［J］.Drug Metab Dispos，2000，28（6）：655-660.

［13］Dufek MB，Bridges AS，Thakker DR.Intestinal first-pass metabolism by cytochrome P450 and not P-glycoprotein is the major barrier to amprenavir absorption［J］.Drug Metab Dispos，2013，41（9）：1695-1702.

［14］Zhang S，Morris ME.Effects of the flavonoids biochanin A，morin，phloretin，andsilymarinonP-glycoprotein-mediated transport［J］.J Pharmacol Exp Ther，2003，304（3）：1258-1267.

［15］Xia CQ，Milton MN，Gan LS.Evaluation of drug-transporter interactions using in vitro and in vivo models［J］.Curr Drug Metab，2007，8（4）：341-363.

Influence of Amomum Villosum Lour and Exocarpium Citrl Grandis on Liver CYP3A and Intestinal First Pass Effect in Mice

Wang Yonghui1，Qi Jinfeng2，Lin Mei2，Kong Yonghong1
（1 Pharmacy Department of Zhumadian Central Hospital，Henan Zhumadian 463000，China；2 College of Chinese Materia Medica of Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangdong Guangzhou 510006）

Objective：To investigate the influence of amomum villosum lour and exocarpium citrl grandis on liver CYP3A and intestinal first pass effect in mice so as to guide the clinical drug use.Methods：The mice were randomly divided into control（pure water，10 mL/kg），ketoconazole（1.8 mg/kg）as well as high（30 mL/kg）and low（10 mL/kg）dose amomum villosum lour and exocarpium citrl grandis groups，and treated with the corresponding drugs by lavage，2 times a day for 3 d.The concentration of acetaminophen in serum was determined by spectrophotometry.The microsome was separated from mouse liver by ultracentrifugation，in which the activity of CYP3A was determined by spectrophotometry.Results：The CYP3Aactivity in liver determined using erythromycin and aminopyrine as the substrates showed no significant difference in high and low dose amomum villosum lour and exocarpium citrl grandis groups and in control group（P＞0.05）.However，the APAP concentrations in high and low dose amomum villosum lour and exocarpium citrl grandis groups were significantly higher，while the activity of P-gp coupled ATPase was significantly lower，than those in control group（P＜0.05 or P＜0.01）.Conclusion：Amomum villosum Lour and exocarpium citrl grandis showed no inhibitory or inducing effect on the activity of CYP3A in mouse liver，while showed a certain inhibitory effect on intestinal P-gp activity in mice.

CYP3A；P-glycoprotein；Amomum Villosum Lour；Exocarpium Citrl Grandis

10.3969/j.issn.1672-5433.2015.12.007

2015-08-24）

王永辉，男，硕士，药师。研究方向：药物代谢学。E-mail：wangyonghui400@163.com

孔永红，女，副主任药师。研究方向：临床药学。通讯作者E-mail:kyh1967@126.com