表皮生长因子改善老年大鼠自发运动活性衰退伴随黑质多巴胺含量升高*

郝颖艳 靳玉川 张 建 杜 鹃 张展翅 耿丹丹 韩 硕 黄玉哲 李 媛□ 樊 平△

（1 唐山市工人医院重症医学科，唐山 063000；2 河北医科大学解剖学教研室，石家庄 050017）

运动衰退是机体衰老的标志性事件之一[1-2]。黑质-纹状体多巴胺能体系（nigrostriatal dopaminergic system，NSDAs）衰退与运动功能衰退密切相关[3-4]。衰老伴随NSDAs酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）和多巴胺转运体（dopamine transport，DAT）表达下降[5-6]，同时，衰老过程中NSDAs中多巴胺（dopamine，DA）的含量也下降[7]。近年来的研究显示，纹状体、黑质区DA 的含量，也能很好反映机体的运动功能状态[8-9]。有报道指出，帕金森病（Parkinson’s disease，PD）患者在纹状体DA 完全耗竭的情况下，运动行为缺陷仍在持续进展，说明运动的衰退与黑质DA 的含量下降密切相关[10-11]。表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）是一个包含53 个氨基酸的多肽，是DA 神经元的神经营养因子[12-14]。研究报道，刚出生大鼠给予外源性EGF 可使NSDAs 中TH 和DAT 的表达升高[13，15]；给予新生大鼠EGF 受体抑制剂，可减少NSDAs 中TH 和DAT 的表达[13]。本课题组之前的研究显示，EGF 可提高中年大鼠纹状体DA 的含量[16]，但对老年大鼠TH 和DAT 的表达以及DA 含量的影响未见报道。本实验经皮给予老年大鼠EGF，探讨EGF对老年大鼠自发运动活性，NSDAs 中TH 和DAT的表达以及DA 含量的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

小鼠抗 TH 单克隆抗体（Sigma，T2928），小鼠抗 β-actin 单克隆抗体（Santa Cruz，CA；sc-47778）多巴胺标准品（DA，H8502-5G，纯度＞98%，批号BCBG8676V），二羟基苯乙酸标准品（DOPAC，850217-1G，纯度＞99%，批号1451791V），高香草酸标准品（HVA，H1252-250MG，纯度＞98%，批号061M1233V），均购自Sigma 公司；对乙酰氨基酚（内标，IS，纯度＞99%，批号：100018-200408，中国食品药品检定所）；乙腈（色谱纯）、甲酸（色谱纯）、乙酸铵（色谱纯）均购自迪马公司。健康雄性SD 大鼠36 只，鼠龄分别为6 月龄和24 月龄，由河北医科大学实验动物中心提供。

1.2 动物分组

实验动物分为成年组（6 月组）、老年组（24月组）和老年EGF 处理组（24 月-EGF 组），每组12只。实验动物自由进食水，室温恒定（22℃±2℃），12 h 亮黑（早6 点开灯）循环。

1.3 经皮给予外源性 EGF

实验方法参照Iwakura 等方法[13]，实验动物10%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔麻醉，常规碘伏消毒背部皮肤，做2 cm宽横切口。将EGF（0.1 mg/mL；HigetaSyoyu，Chiba，Japan）的Azlet 真空泵（model 2002；AzlaCoip.Palo Alto，CA，USA）沿背部皮肤切口送至肩部皮下并埋于其中，缝合伤口，碘伏消毒。将含0.9%生理盐水的真空泵埋入肩部皮下作为对照。所有动物7 d 后进行行为学实验。

1.4 旷场试验

实验方法参照本课题组前期的方法[16]，将大鼠放置由长×宽×高为 100 cm×100 cm×40 cm的无盖立方形装置中，记录大鼠静止闻嗅行为、探索行为、运动行为和理毛行为参数。

1.5 取材

行为学实验结束后，将大鼠断颈处死，迅速取出脑组织，并参照以前文献取出黑质和纹状体（尾壳核）[17]。将各组分别取出6 个脑组织的黑质用于实时定量PCR 检测。剩下的6 个脑组织，左侧黑质和纹状体（尾壳核）用于免疫印迹检测，右侧黑质和纹状体（尾壳核）用于液相色谱-串联质谱分析。

1.6 实时定量PCR 检测TH mRNA 和DAT mRNA 的表达

TRIzol 一步法提取RNA，紫外分光光度计测定RNA 浓度和A260/280 比值。TH 上游引物5′-CCCC ACCTGGAGTATTTTGTG-3′，下游引物5′-ATCAC GGGCGGACAGTAGACC-3′；DAT 上游引物5′-AG CTACCATGCCCTATGTGG-3′，下游引物5′-ATCC ACACAGATGCCTCACA-3′；内参β-actin 上游引物5′-TCATGAAGTGTGACGTTGACATCCGT-3′，下游引物5′-CCTAGAAGCATTTGCGGTGCACGA TG-3′。反转录合成cDNA 后进行PCR 扩增，反应条件95℃，10 min；95℃，15 s；58℃，20 s；72℃，27s。扩增产物由融合曲线分析确认。

1.7 免疫印迹检测TH 和DAT 的表达

将黑质和纹状体（尾壳核）组织块置于RIPA裂解液中，4℃冰上裂解2 h；4℃离心，12 000 r/min，20 min，取上清液测蛋白浓度；等量总蛋白上样，4%浓缩胶恒压90 V、10%分离胶恒压120 V 电泳，恒流300 mA 转膜1 h；5%脱脂奶粉室温封闭1 h，TBST 稀释小鼠抗TH 单克隆抗体（1∶1 000，Sigma；T2928）、兔抗 DAT 多克隆抗体（1∶1 000，Millipore，Temecula，CA；AB2231）、小鼠抗 β-actin 单克隆抗体（1∶1 000，Santa Cruz，CA；sc-47778），4 ℃孵育过夜；TBST 清洗3 次，IRDye800CW 荧光素表达的二抗（1∶10 000；Rockland）室温孵育1 h，Odyssey 双色红外激光成像仪扫描。以β-actin 作为内参，用目的蛋白与内参条带的吸光度比值进行结果分析。

1.8 液相色谱-串联质谱分析DA 的含量

将取出的黑质和纹状体（尾壳核）组织块按5 μL/mg 加入80%乙腈（含0.1%甲酸）溶液，匀浆，冰水浴超声5 min，4℃离心（14 000 r/min）10 min，取上清液100 μL 至离心管中，依次加入20 μL 内标（对乙酰氨基酚，400 μg/mL），20 μL 80%乙腈（0.1%甲酸），涡流混旋2 min，14 000 r/min、4℃离心10 min，取上清液100 μL 至自动进样小瓶，进样20 μL 进行液相色谱-串联质谱（LCMS/MS）（Applied Biosystems，Foster City，CA，USA）分析，记录色谱图。

1.9 统计学处理

所有参数以±s表示。采用SPSS 12.0 软件进行统计分析，首先通过Kolmogorov-Smirnov 检验和Levene's 检验方法分别检验正态性和方差齐性。如果正态性（P＞0.1）和方差齐性（P＞0.1）均满足时，采用单因素方差分析，两组之间多重比较采用Student-Newman-Keuls 检验。如果正态性（P＞0.1）和（或）方差齐性（P＞0.1）不满足，采用Kruskal-Wallis 非参数检验，P＜0.05 后两组之间多重比较采用Mann-WhitneyU检验。P＜0.05 代表差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EGF 对老年大鼠旷场试验行为参数的影响

2.1.1 静止闻嗅行为 旷场实验结果显示，6 月、24 月和24 月-EGF 3 组间大鼠静止闻嗅行为存在明显不同（P＜0.01）。与 6 月组相比，24 月组老年大鼠静止闻嗅行为降低了51.90%（P＜0.01），EGF 处理使老年大鼠静止闻嗅行为上升47.37%（P＜0.01），但没有达到6 月组水平（P＜0.01）（图1）。

图1 EGF 对老年大鼠静止闻嗅行为的影响

2.1.2 探索行为 大鼠的探索行为包括行走中间闻嗅行为、前腿倚靠四壁直立行为、前腿未倚靠四壁直立行为和闻嗅行为。实验结果显示，6 月、24月和24 月-EGF 3 组间行走中间闻嗅行为（P＜0.01）、前腿倚靠四壁直立行为（P＜0.01）、前腿未倚靠四壁直立行为（P＜0.01）和闻嗅行为（P＜0.01）4 种行为的次数存在显著差异。与 6 月组相比，24 月组老年大鼠行走中间闻嗅行为、前腿倚靠四壁直立行为、前腿未倚靠四壁直立行为和闻嗅行为分别降低了73.20%（P＜0.01）、59.42%（P＜0.01）、62.86%（P＜0.01）、55.04%（P＜0.01），EGF 处理使老年大鼠上述4 种行为的次数上升119.23%（P＜0.01）、71.43%（P＜0.01）、76.92%（P＜0.01）、46.55%（P＜0.01），但未达到6 月组水平（P＜0.01）（图2）。

图2 EGF 对老年大鼠探索行为的影响

2.1.3 运动行为 大鼠的运动行为参数包括垂直运动、水平运动和总径长。实验结果显示，6 月、24 月和24 月-EGF 3 组间大鼠垂直运动次数（P＜0.01）、水平运动次数（P＜0.01）和总径长（P＜0.01）存在显著差异。与 6 月组相比，24 月 组老年大鼠垂直运动次数、水平运动次数和总径长分别降低了56.98 %（P＜0.01）、51.70%（P＜0.01）、58.32%（P＜0.01），EGF 处理使老年大鼠上述指标分别上升62.34 %（P＜0.01）、42.72%（P＜0.01）、33.91%（P＜0.01），但没有达到6 月组水平（图3）。

图3 EGF 对老年大鼠运动行为的影响

2.1.4 理毛行为 大鼠的理毛行为包括理毛潜伏期、理毛次数和理毛持续时间。6 月、24 月和24月-EGF 3 组间大鼠间理毛潜伏期（P＜0.01）、理毛次数（P＜0.01）和理毛持续时间（P＜0.01）存在显著差异。与 6 月组相比，24 月组老年大鼠理毛潜伏期上升了312.50%（P＜0.01），理毛次数和理毛持续时间分别降低了62.96%（P＜0.01）和51.57%（P＜0.01）。EGF 处理后理毛潜伏期下降了18.42%（P＜0.01），理毛次数和理毛持续时间分别上升了31.25%（P＜0.01）和30.51%（P＜0.01），但未达到6 月组水平（P＜0.01）（图4）。

图4 EGF 对老年大鼠理毛行为的影响

2.2 EGF 对老年大鼠NSDAs 中TH 和DAT 表达的影响

2.2.1 TH mRNA和DAT mRNA的表达 6月、24月和24月-EGF 3组间TH mRNA（P＜0.01）和DAT mRNA（P＜0.01）存在显著差异。与6月组相比，24月组老年大鼠黑质处TH mRNA和DAT mRNA的相对表达降低了48.53%（P＜0.01）和51.81%（P＜0.01），EGF处理后 TH mRNA和DAT mRNA的表达分别上升27.18%（P＜0.01）和38.30%（P＜0.01），但未达到6月组水平（P＜0.01）（图5A、图5B）。

图6 EGF 对老年大鼠黒质和尾壳核内DA 含量的影响

2.2.2 老年大鼠黑质多巴胺神经元TH 和DAT 表达 6 月、24 月和24 月-EGF3 组大鼠间黑质处TH（P＜0.01）和DAT（P＜0.01）以及纹状体（尾壳核）处TH（P＜0.01）和DAT （P＜0.01）与β-actin 免疫印迹条带相对吸光度比值均存在显著差异。24 月组老年大鼠黑质处的TH 和DAT 的相对表达与6 月组相比分别降低了57.80%（P＜0.01）和59.02%（P＜0.01），尾壳核处TH 和DAT 的相对表达与6月组相比分别降低了53.45%（P＜0.01）和60.73%（P＜0.01）。EGF 处理后，24 月-EGF 组大鼠黑质处TH 和DAT 的相对表达比24 月组提高了63.85%（P＜0.01）和91.53%（P＜0.01）；纹状体（尾壳核）处TH 和DAT 的相对表达比24 月组提高了66.89%（P＜0.01）和50.45%（P＜0.01），但均未恢复到6 月组水平（P＜0.01）（图5C～图5F）。

2.3 EGF 对老年大鼠NSDAs 中DA 含量的影响

6 月、24 月和24 月-EGF3 组大鼠间黑质处DA含量（P＜0.01）和纹状体（尾壳核）处DA 含量（P＜0.01）存在显著差异。24 月组老年大鼠黑质处DA的含量比6 月组降低了41.85%（P＜0.01）。EGF 处理后，24 月-EGF 组黑质处DA 的含量与24 月组相比提高了47.78%（P＜0.01），但未恢复到6 月水平（P＜0.01）。24 月组老年大鼠纹状体（尾壳核）处DA 的含量比6 月组降低了47.60%（P＜0.01）。EGF处理后，24 月-EGF 组纹状体（尾壳核）处DA 的含量与24 月组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

研究表明，衰老常表现出与年龄相关的运动行为衰退[1]。旷场试验是检测DA 能神经元功能活动的敏感方法[18]，能反映动物的自发运动行为活性。以往的研究显示，老年大鼠旷场行为中的静止闻嗅行为、探索行为、运动行为和理毛行为均显著衰退[4，19]，我们的实验结果与之前相符。EGF 处理后，老年大鼠的上述旷场均显著改善，理毛潜伏期也恢复到接近正常水平，说明EGF 可以改善老年大鼠自发运动活性衰退。

在NSDAs 中，TH 是DA 合成的限速酶[20]，由TH 的活性变化导致DA 合成或信号改变被认为与PD 或其他神经系统疾病相关[21-22]。DAT 是突触前膜蛋白，通过重摄取突触间隙的DA，调节DA 的可用性[23]。研究表明DAT 敲除鼠NSDAs 中DA 的水平下降[24]。在大鼠NSDAs 中，黑质是DA 神经元胞体和树突聚集的部位，尾壳核是DA 神经元投射的重要靶区。现有研究表明，衰老过程中黑质和尾壳核处TH 和DAT 的表达均下降，并且与运动行为衰退密切相关[5-6，22-24]。本实验结果显示，老年大鼠黑质和尾壳核处TH 和DAT 的mRNA 和蛋白表达均较成年大鼠显著下降，与前人研究结果相符。给予EGF 后，黑质和尾壳核处TH 和DAT 的mRNA和蛋白表达均升高，表明EGF 改善老年大鼠运动衰退与提高NSDAs 中TH 和DAT 的表达有关。有报道指出，PD 出现的运动缺陷伴随纹状体处DA的含量下降达80%以上[25-27]，但正常衰老过程中出现的运动衰退，纹状体DA 含量的下降通常不超过50%[9，28-29]。此外，即便纹状体DA 耗竭，PD 患者的运动缺陷仍会继续加重[10-11]。因此，纹状体DA 的含量下降不是唯一反映运动衰退的指标。有报道指出，黑质处DA 的含量在衰老或PD 时，有20%～40%的下降[8，30-32]。衰老或PD 模型鼠补充外源性胶质源性生长因子可引起自发运动活性、黑质处TH 的表达以及DA 的含量上升[33]。给予中年大鼠热量限制干预，可改善自发运动活性衰退伴有黑质（而非尾壳核）处DA 的含量上升[9，28]。因此，黑质处DA 的含量也是反映运动功能的重要指标。本实验结果显示，老年大鼠黑质处和尾壳核处DA 含量与成年大鼠相比均显著下降。给予EGF处理后，黑质处DA 的含量显著上升，而尾壳核处DA 的含量没有统计学意义，提示EGF 改善老年大鼠自发运动活性衰退与黑质（而非尾壳核）处DA的含量升高有关。本实验之所以会出现尾壳核处DA 的含量在EGF 处理后未升高，考虑与DAT 的表达在黑质处和尾壳核处上升程度不同有关。EGF 处理后，DAT 在黑质处上升91.53%，在尾壳核处上升50.45%，导致DA 在尾壳核处突触间隙未被重摄取的多，而突触间隙未被重摄取的DA 会被儿茶酚胺-O-甲基转移酶降解，因此DA 在尾壳核处被降解的多，导致DA 的总量没有升高。

综上，本次实验结果显示，EGF 可改善老年大鼠自发运动活性衰退与提高黑质（而非尾壳核）处DA 的含量有关。