新生大鼠缺氧缺血性损伤致脑白质自噬体形成增多*

陈 烨 吴 斌 钟秀容 周琳瑛△

（福建医科大学，1 附属协和医院麻醉科，2 附属福州第一医院麻醉科，3 公共技术中心电镜室，福州 350004）

自噬是被称为Ⅱ型程序性细胞死亡，它通过依赖于溶酶体的降解途径实现细胞质蛋白和细胞器更新。目前发现自噬与缺氧缺血；感染、肿瘤等多种病理过程有关。细胞在受到外界因素刺激（如饥饿、低氧、高温）或在细胞内部应激（如损伤、过多细胞器和胞质成分积聚）的情况下都可以诱导自噬现象的发生[1]。研究表明组织器官缺氧缺血可以诱导自噬发生。国外也有研究表明，新生儿缺氧性脑损伤后可引起自噬相关蛋白表达增高[2-4]，提示自噬亦参与新生儿缺氧缺血性损伤的病理过程，但国内这方面报道极少。本研究采用3日龄（P3）大鼠颈动脉结扎结合缺氧缸的方法模拟早产儿缺氧，观察不同缺氧时间段脑白质自噬小体及自噬蛋白变化以及髓鞘病变和髓鞘相关蛋白（myelin basic protein，MBP）表达情况。

1 材料和方法

1.1 实验动物和试剂

选取P3 SD大鼠共80只，体质量（8.05±0.24）g，雌雄不拘，所有动物由福建医科大学实验动物中心提供。所有实验遵循随机和双盲原则。

兔抗大鼠LC3B 抗体购自美国Novus 公司；兔抗大鼠MBP 抗体购自英国Abcam 公司，兔抗大鼠β-actin 抗体购自美国Santa Cruz 公司，二抗羊抗兔IgG 抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司，RIPA 裂解液及超敏ECL 化学发光试剂盒购自上海碧云天公司。

1.2 建立动物模型及分组

P3 大鼠同窝随机配对到缺氧缺血组（HI 组）和假手术组（sham 组），每组40 只，参照前期研究[6]略做些改进制作新生鼠缺氧缺血性脑损伤模型，具体如下。

实验大鼠左侧颈总动脉结扎回笼恢复2 h 后，将2 组大鼠分别放入自制且完全对称的2 个动物培养箱中（体积约为4.5 L），HI 组的培养箱内放置单氧浓度监测仪（GAXT-X 加拿大BW 公司），向缺氧箱内输入（6% O2+94% N2）混合气体使缺氧仓内氧浓度稳定在6.1%不变；sham 组培养箱内的氧浓度保持在22%左右。室内温度维持在24℃～26℃，大鼠缺氧2 h 后取出大鼠，恢复 10 min 后再回原笼饲养直至取材。

1.3 收集脑组织标本

Sham 组和HI 组大鼠分别于造模后24、48、72 h 和5、7 d 处死，每个时间点取8 只，每只实验动物麻醉处死后在冰上取材，取颈总动脉结扎侧脑室周围脑白质组织，分成2 部分，一部分3%戊二醛-1.5%多聚甲醛固定，4℃保存，留做电镜观察；另一部分脑白质组织直接低温（-80℃）冻存，留做免疫印迹检测。

1.4 免疫印迹检测

取脑室周围白质组织称重，按照每20 mg 组织加入200 μL 裂解液的比例加入RIPA 裂解液，冰浴中进行匀浆后冰上放置30 min，将样品转移至1.5 mL Eppendorf 管中，4 ℃ 12 000 r/min 离心 20 min，取上清。按常规免疫印迹法步骤处理，包括蛋白浓度的测定、标准曲线制作、SDS-聚丙酰胺凝胶电泳、转膜、封闭、最后加入一抗（LC3 1∶2 000，MBP 1∶1 000，β-actin 1∶4 000），4℃孵育过夜。TBST 液洗涤，后加入二抗，室温摇床1 h，BeyoECL Plus 化学发光试剂盒显色，然后显影及定影，凝胶图像分析系统观察拍照。

1.5 电镜观察大鼠脑白质纤维结构变化

收集每组3 只大鼠脑白质标本，3%戊二醛-1.5%多聚甲醛固定，4℃过夜，PBS 漂洗，1%锇酸后固定4℃ 1 h，经50%、70%、90%、100%乙醇、100%丙酮逐级脱水，Epon618 浸透，包埋，超薄切片经铅铀双染后，FEI TecnaiG2 透射电镜观察并拍照。

1.6 统计学处理

数据采用SPSS 17.0统计软件处理，正态分布的计量资料以±s表示，各组间比较采用方差分析。

2 结果

2.1 透射电镜观察

电镜下可见sham 组大鼠脑白质细胞和细胞突起结构完整，细胞内可见线粒体、内质网等细胞器，组织内未见自噬体形成；HI 24 h 组大鼠脑白质区少部分细胞突起内出现双层膜包裹的自噬体（图2），在缺氧缺血48 h 时自噬现象最明显，在突起内成堆分布，累及的突起范围也较弥漫，有的自噬体的内容物类似髓鞘样结构，电子密度也与髓鞘类似（图3）；缺血72 h 自噬体及自噬溶酶体在突起内的数量及累及突起和缺血24 h 比均减少。HI 7 d组，脑白质内可见疏松髓鞘结构，轴索也缺失；而sham 7 d 组，可见结构完整、板层结构清晰的髓鞘，轴索也完好（图1）。

2.2 LC3 及MBP 蛋白表达

与sham 组比较，HI 24 h组和48 h组大鼠脑白质中自噬体相关蛋白LC3Ⅱ表达水平升高，与相应的对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05，图2）。

Sham 5d 和HI 5d均不表达MBP，sham 7 d组表达MBP，与sham 7 d 组相比，HI 组在造模后第7 天观察到脑白质中的MBP 表达下调（P＜0.05）（图3）。

3 讨论

研究表明，大鼠出生后2～5 d 的大脑发育水平与人类胎龄为23～32 周的早产儿相似，其脑白质处于缺氧缺血易损期，同时也是合成神经髓鞘的高峰期；这个时期大脑缺氧缺血最容易造成脑白质损伤，笔者前期实验采用P3 SD 大鼠单侧颈总动脉结扎联合（6%O2+94%N2）混合气体培养已成功建立新生鼠脑白质损伤模型，也证实了新生鼠缺氧缺血后MBP 表达下调[5]。

自噬是存在于真核细胞中的生命现象，其参与清除细胞废物、结构重建等生命活动，是细胞维持稳态和对不良环境的一种防御机制[6]；保持一种低水平的、基础自噬活性对细胞生存非常重要。因为细胞中每时每刻都在产生“废物”（错误合成或折叠错误的蛋白质、损坏或衰老的细胞器、长寿蛋白质等等），这些“废物”必须被及时清除，而这个过程主要依靠自噬完成[1]，因此，自噬具有维持细胞自稳的功能。自噬也参与多种疾病的病理过程，无论是自噬过度还是不足都可导致疾病发生。

图1 脑白质组织透射电镜观察，标尺=300 nmFig1 Pathology changes of cerebral white matter in transmission electron microscopy（TEM），bar=300 nm

图2 新生鼠脑白质LC3 Ⅱ蛋白的表达Fig2 LC3 expression in the cerebral white matter of neonatal rats

图3 Sham 组及HI 组大鼠左侧脑白质中MBP 的表达情况Fig3 Immunoblots of MBP in the cerebral white matter of neonatal rats

随着自噬的发生发展，哺乳动物细胞中的Atg8 同源染色体编码合成LC3B，而LC3B 则被 Atg4 分解成LC3 I，使其羧基末端的甘氨酸残基暴露出来，从而与E1 样酶Atg7 结合并被激活，活化的LC3 I再被转运至E2样酶Atg3修饰成LC3 Ⅱ，LC3 Ⅱ则结合到自噬体和自噬体前体膜上，由此可见LC3 Ⅱ是自噬体膜形成的必要成分，所以被公认为自噬体的标记蛋白，所以LC3 Ⅱ常被作为自噬水平高低的指标运用于各种细胞自噬研究[7]。

国内外研究均证实缺血再灌注过程能够诱导自噬水平的快速上调，但是关于自噬在再灌注损伤中的作用却有不同结论[2-4，8]。Carloni 等[2]报道在新生鼠缺氧缺血模型中，自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤可通过抑制自噬，下调自噬相关蛋白Beclin1 促使细胞走向坏死，自噬诱导剂雷帕霉素则通过诱导自噬，上调Beclin 1 蛋白并减少细胞坏死从而减轻大脑损伤程度，提示在新生鼠大脑缺氧缺血早期阶段，诱导自噬是一种潜在的神经保护机制。Wang 等[3]的研究则显示七氟醚处理后，通过激活细胞外信号调节的激酶级联反应抑制自噬，减轻新生大鼠的缺氧缺血性脑损伤。Li 等[4]研究显示新生鼠缺氧缺血损伤后Beclin 1 表达逐渐增加，其增加趋势与神经元数量增加时间窗一致，而推测自噬可能有神经保护作用。Shi 等[8]报道缺血再灌注后3 h，阻断自噬有神经保护作用，并认为这一相反的结果证明了自噬的双重作用：自噬在早期阶段保护神经变性，晚期则有害，这取决于给药时间。

本研究应用透射电镜观察及自噬相关蛋白LC3 Ⅱ蛋白半定量均提示HI 24 h 组即在细胞突起内出现自噬小体，且在HI 48 h 组自噬体明显增多，HI 72 h 组自噬小体比HI 48 h 组少，提示新生鼠脑缺氧后自噬产生的高峰是在缺氧缺血48 h。MBP是组成髓鞘的主要蛋白质之一，在髓鞘形成和脑分化发育过程中起着重要作用。其含量变化反映中枢神经系统有无实质性损害，特别是有无髓鞘脱失的较特异的生化指标。有实验表明小鼠选择性自噬相关基因7（Atg7）敲除后可以减低照射引起小脑白质中少突胶质细胞祖细胞的丢失，从而阻止照射引起的髓鞘破坏[9]。本研究结果显示，部分HI 5 d 大鼠出现MBP 表达，但和sham 组比较差异无统计学意义，而HI 7 d 大鼠MBP 表达下降明显，且HI 7 d大鼠脑白质内形成的髓鞘结构疏松，不完整，轴索缺如。提示MBP 表达水平的下调可能由于自噬介导的髓鞘相关蛋白降解引起，该结论有待于更深入研究进一步证实。