牙髓干细胞在组织工程及再生医学中的应用研究进展*

王付燕 杜立群

（山东大学齐鲁医院眼科，济南 250012）

理想的种子细胞是组织工程领域研究的重点，必须具有来源丰富、易于分离培养、体外培养及重建过程具有较强的增殖能力并长期维持生理功能及生物活性、能控制分化方向及应用安全等特点。2000年，Gronthos等[1]利用消化酶法将人类健康第3磨牙牙髓制备成单细胞悬液，经过培养得到能够形成细胞克隆和具有高度增殖能力的细胞，并将其命名为牙髓干细胞（dental pulp stem cells，DPSCs）。DPSCs取自牙髓组织，具有良好的生物学特性，如高度增殖、自我更新能力和多向分化潜能，自体移植能最大限度降低免疫排斥反应和交叉感染风险，来源丰富，取材简便，不对人体造成二次伤害且不涉及伦理问题。近年来，DPSC在组织工程及再生医学方面的应用日益受到研究者关注，现对其研究进展进行综述。

1 DPSCs的生物学特性

1.1 多向分化、高度增殖潜能

DPSCs来源于胚胎时期神经嵴的骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenehymal stem cells，BMMSCs）[2-3]，表达间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）的表面标记SH2、SH3、SH4和胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）的表面标记OCT 4、NANOG、SSEA-3和SSEA-4。体外培养具有向三胚层（内、中、外）细胞分化的能力[4-5]。研究显示，体外培养的DPSCs呈梭形，在适当的诱导条件下可分化成为破骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞、毛囊细胞、角膜上皮细胞、神经细胞和黑色素细胞等[6]。虽然DPSCs和BMMSCs均可向骨、软骨、肌肉、脂肪和神经方向分化，然而DPSCs却表现出更高的分化能力，其增殖速度是BMMSCs的30～50倍[7-8]，提示DPSCs将为组织修复再生医学的发展提供新的发展方向。

1.2 免疫调节能力

DPSCs和BMMSCs均具有强大的免疫调节能力。研究表明[9]，DPSCs具有诱导活化T细胞凋亡、减轻免疫相关组织损伤的能力。FasL（Fas ligand，FasL）是一种跨膜蛋白，在Fas凋亡通路中发挥重要作用。利用siRNA技术敲除DPSCs中FasL能降低其诱导T细胞凋亡的能力，并能降低其抗炎疗效，说明DPSCs免疫调节能力由FasL调控。然而，FasL表达水平并不影响DPSCs的增殖速率和多向分化能力。动物实验表明[10]DPSCs具有显著抑制辅助性Th17细胞（T helper 17，Th17）的作用，移植DPSCs后能够逆转系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）相关功能障碍。Ding等[11]研究显示，DPSCs通过分泌转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）抑制淋巴细胞增殖。将DPSCs移植到缺血缺氧小鼠模型中，能产生抗炎反应并促进组织修复[12]。He等[13]报道脂多糖能够刺激DPSCs高表达白细胞介素-8（interleukin-8，IL-8），IL-8是趋化因子家族的细胞因子，对中性粒细胞有趋化能力，在调节炎症反应中发挥重要作用，如果DPSCs诱导分化后仍然具有与未分化时相似的免疫调节能力，可以通过调节免疫特性成为治疗免疫疾病的干细胞资源。

1.3 旁分泌作用

体内实验显示，DPSC能通过旁分泌形式分泌-系列细胞因子[14-20]，如基质细胞衍生因子-1（chemokine stromal cell-derived factor-1，SDF-1）、脑源性神经生长因子（brainderived neurotrophic factor，BDNF）、睫状神经生长因子（ciliary neurotrophic factor，CNTF）、胶质细胞衍生的神经营养因子（glial cell-derived neurotrophic factor，GDNF）、神经生长因子（nerve growth factor，NGF）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、粒细胞集落刺激因子（granulocyte-colony stimulation factor，G-CSF）和干细胞因子（stem cell factor，SCF），这些细胞因子具有促进新生血管生成、抗凋亡及保护再生组织的作用。Song等[21]研究显示，DPSCs在缺血性动物模型中对星形胶质细胞表现出优越的细胞保护作用。将DPSCs植入局灶脑缺血后24 h内啮齿类动物模型的大脑中，4周时可见动物神经学行为得到极大改善，而且对侧前肢的感觉运动功能明显提高，虽然此时植入的DPSCs仅有约2.3%的存活率，但是这些细胞能定向迁移到大脑缺血区域，并分化为星形胶质细胞或神经细胞，研究者提出这种功能的改善不是神经的替换而更多的是依赖于DPSCs的旁分泌作用[22]。DPSCs还能诱导小鼠动物模型后肢局部缺血处功能性新生血管形成[23]。

2 DPSCs在组织工程及再生医学研究中的应用

2.1 在牙修复重建中的应用

龋齿和牙髓炎严重影响患者的生活质量，目前主要采用根管治疗，即清除髓腔内的牙髓组织并应用合成材料填充髓腔，治疗后的牙齿脆弱、易于骨折并有再次感染可能。Asghari等[24]将DPSCs放在含有地塞米松（dexamethasone，DXM）、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠以及骨形成蛋白-7（bone morphogenetic protein 7，BMP-7）的培养基中诱导培养，显示新生的成牙本质样细胞以及大量的钙结节和胶原沉积形成，并表达碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、骨钙蛋白（osteocalcin，OCN）、牙本质涎磷蛋白（dentin sialophosphopmtein，DSPP）、牙本质基质蛋白-1（dentin matrix protein，DMP-1）等成分。周慧等[25]提出，转化生长因子β3与肝素联合作用可诱导人类乳牙牙髓干细胞（human immature dental pulp stem cells，HIDPSCs）分化为成牙本质细胞、ALP活性增强、DSPP表达增加。Tran等[26]将DPSCs与人类牙本质共培养并移植到小鼠模型中，显示牙本质样组织形成。张红梅等[27]研究表明，小肠黏膜下层浸提液能明显刺激体外培养的DPSCs增殖，诱导细胞矿化并能提高细胞ALP水平，诱导后的DPSCs表达DSPP和DMP-1。DPSCs在体外构建组织工程牙将逐渐成为可能，这对于提高缺牙患者的生活质量具有远大意义。

2.2 在骨修复重建中的应用

骨基质具有独特的矿化能力，寻找理想的种子细胞是骨组织工程研究的热点。由于成骨细胞起源于BMMSCs，而DPSCs又是BMMSCs的一种，因此Kermani等[28]将DPSCs在含有抗坏血酸、β-甘油磷酸钠、胎牛血清、青霉素/链霉素、MEM的成骨诱导培养基中诱导培养后，显示DPSCs可以向成骨细胞分化，并表达成骨标志物：ALP、骨桥蛋白（osteopontin，OPN）和OCN，另外DPSCs还具有骨特有的矿化能力[29]，能形成钙盐沉积和矿化结节，是骨再生修复中成骨细胞的潜在干细胞来源。文军等[30]研究显示，改良富血小板血浆对HIDPSCs的增殖和成骨分化具有一定的促进作用，且体积分数为2%的改良富血小板血浆促增殖能力最强，碱性磷酸酶活性达到最高。这就表明适宜质量分数的富血小板血浆可以显著促进DPSCs的成骨分化能力。Chamieh等[31]将DPSCs与蚕丝蛋白支架共同培养，DPSCs表现出较高的矿化能力，能够分化为骨组织，并能表达OCN和胶原蛋白。Wolosz等[32]通过DPSCs与胶原蛋白凝胶支架结合促进大鼠颅面骨的愈合，显示再生骨骨密度、纤维结缔组织以及矿化骨组织的体积明显增加。早在2009年，DPSCs在骨组织缺损修复领域已进入临床研究阶段[33]，但其具体的调控机制仍然存在很多问题，有待进一步探索研究。

2.3 在神经修复重建中的应用

脊髓损伤后，神经元、神经胶质细胞损伤，残余的轴突难以再生从而导致持续性神经功能障碍。DPSCs是神经嵴来源的干细胞，具有分化为神经细胞的潜能，其研究为神经系统疾病的治疗开辟了新思路。方成志等[34]应用含氢化可的松、二甲基亚砜、丁羟基茴香醚、forskolin、β-巯基乙醇的条件培养基诱导DPSCs，能分化为神经元样细胞和神经胶质细胞，并能表达神经细胞特异型标志巢蛋白和胶质纤维酸性蛋白。研究表明，移植HIDPSCs对脊髓损伤具有显著的治疗效果，其促进神经再生的主要机制为：（1）抑制早期炎症反应；（2）抑制脊髓损伤导致的神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞的凋亡，保护神经纤维和髓鞘；（3）通过旁分泌的形式直接抑制轴突生长抑制因子（髓鞘相关糖蛋白、硫酸软骨素蛋白多糖）的释放；（4）在脊髓损伤部位，DPSCs分化为成熟的神经元和少突胶质细胞，促进轴突的生长，这表明HDPSCs在神经损伤再生治疗中的应用潜力，有望成为修复脊髓损伤一种安全有效又可靠的临床治疗手段[35-36]。最近研究[37]报道含混合生长因子音猬因子（sonic hedgehog，SHH）、纤维母细胞生长因子8（fibroblast growth factor 8，FGF-8）、GDNF和毛喉素（forskolin）的培养基能诱导人SHEDs分化成包含DA能神经元的细胞群。

2.4 在肌肉修复重建中的应用

杜氏肌肉营养不良症（DMD）是由于缺乏功能性结构蛋白肌，导致严重的肌肉萎缩症、行动不便，患者通常在20岁左右时就会因为心肌、肺肌无力而死亡。Chen等[38]研究显示，抑制miR-143的表达能显著增强肌分化因子和快肌凝蛋白重链基因的表达，并提出miRNA 参与调节脊椎动物不同肌肉类型功能的表达。Li等[39]用5-氮杂-2'-脱氧胞苷处理DPSCs，miR-135和miR-143表达明显受到抑制，DPSCs表现出显著的成肌特性并有肌小管形成，由此得出miRNAs 在诱导DPSCs肌源性分化的过程中起到决定性作用。另有研究者[40]报道，DPSCs能够从减小纤维化和促进血管生成两个方面来改善DMD小鼠模型营养不良骨骼肌组织的病理状态，这些结果为进一步研究将DPSCs更有效用于肌肉修复再生的机制铺平了道路。

肌肉萎缩症是X连锁隐形遗传病，平均每3 500个男性新生儿中就有1个肌肉萎缩症患儿。曾有研究者[41]提出DPSCs可表达特异性的成肌细胞表面标志物α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin），在适当的培养条件下可开启成肌特异性基因并分化为肌源性细胞，将DPSCs与鼠肌C2C12细胞在嗜酸乳杆菌培养基中共同培养可观察到肌管融合现象[42]。此后有研究者将DPSCs注射到患肌肉萎缩症的金毛猎犬体内，免疫荧光检测显示肌纤维形成，肌萎缩症状明显改善[43]。急性心肌梗死裸鼠心肌注射DPSCs 4周，梗死区大量新生血管生成、梗死面积明显减小，左心室功能显著提高[44]，提示DPSCs是治疗肌肉萎缩和急性心肌梗死潜在的干细胞来源。

2.5 在角膜修复重建中的应用

角膜盲是严重的致盲性眼病，目前主要治疗方法是同种异体角膜移植，供体来源匮乏及免疫排斥反应等限制了其临床应用。组织工程角膜构建是目前眼科界研究的热点，理想的种子细胞是其中的关键要素。Monteiro等[45]报道DPSCs体外可持续表达角膜缘干细胞（1imbal stem cell，LSC）特异性标记物，随后该团队又将组织工程人未成熟DPSCs植片直接放置在碱烧伤兔角膜暴露的透明角膜基质上，1～12周实验动物角膜透明度逐渐改善，组织学分析显示角膜烧伤处有形态良好的基质层结构和复层上皮形成，证明接种人未成熟DPSCs能够促进碱烧伤动物角膜形成功能性的角膜上皮组织[46]。Kushnerev等[47]以角膜接触镜为载体成功地将DPSCs移植到角膜表面，并检测到角膜上皮标记物CK3、CK12等的表达，再次证实了DPSCs向角膜上皮细胞分化的潜能。并且相关研究[48]提出DPSCs能够促进角膜上皮细胞生长及角膜上皮再生，并具有阻止角膜结膜化，维持角膜透明的能力。Syedpicard等[49-50]报道DPSCs经体外诱导后具有分化为角膜基质细胞、角膜蛋白和硫酸角质素的能力，说明DPSCs具有分化为角膜基质细胞的潜能。这些研究证明，DPSCs在角膜再生组织工程研究中具有潜在的临床应用价值，但是未来还需要进一步的研究探索DPSCs促进受损角膜再生的机制。

2.6 其他

随着组织工程学及交叉学科的融合发展，DPSCs在组织工程及再生医学研究的应用领域也逐渐拓展。Han等[51]提出DPSCs能够分化成肝细胞样细胞并具有储存糖原和生产尿素的功能，为肝病提供了有前景的治疗方法。相关研究[52]提出DPSCs能分化为胰岛素生成细胞，有望为糖尿病的治疗开辟另一条崭新的途径。

3 问题和展望

DPSCs多取材于自然替换的乳牙、第3磨牙、正畸牙或其他原因需要拔除的牙，是自体移植中容易获取的种子细胞来源，具有作为组织工程种子细胞的诸多优势，呈现出良好的临床应用前景。尽管对DPSCs的研究应用已取得很多的突破，但是主要局限在动物模型上，要想将其成功用于临床组织再生，还存在着诸多问题，如DPSCs的特异性表面标记物至今仍不明确；牙髓组织中难以确切定位；分化调控机制尚不清楚；体外培养周期长，难以大量扩增以及分化的哪个时期最适合移植等。

但是相信随着组织工程技术的发展进步，生命科学、工程学及材料学等相关学科交叉发展，以及科研工作者的不懈努力，这些问题将会得到更加深入的探讨和逐步解决。DPSCs的研究将日趋完善，并实现真正意义上的组织再生。