HPLC-DAD 法测定复方鲜竹沥液中9 种防腐剂含量

时间：2024-07-28

刘艳梅，许妍，张静，洪挺

江西省药品检验检测研究院，国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室，江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心，江西南昌 330029

复方鲜竹沥液为甲类非处方药，由鲜竹沥、鱼腥草等七味中药组成，临床用于痰热咳嗽、痰黄黏稠的治疗［1］。全国生产该制剂的生产企业共计十家，其中江西企业占据八家，属于江西特色中药制剂。复方鲜竹沥液为液体制剂，液体制剂多以水为溶媒，易被微生物污染而发霉变质，尤其制法中加入矫味剂蔗糖或甜菊素，更易引起微生物的滋生与繁殖。复方鲜竹沥液制法中加入0.3%的苯甲酸钠作为防腐剂，但有关资料显示pH 值对苯甲酸及其钠盐的抑菌效果影响很大，苯甲酸的最佳抑菌pH 值为2.0～4.0，一般以＜5.0 为宜，苯甲酸钠的最适pH 值为≤4［2-5］，而复方鲜竹沥液的pH 值为4.8～6.0［1］。为考察企业是否规范使用防腐剂，本实验选择了中药液体制剂中常用的防腐剂苯甲酸、山梨酸、尼泊金酯类防腐剂（羟苯酯类）以及脱氢乙酸共计9 种进行考察，建立了HPLC-DAD 法同时测定复方鲜竹沥液中9 种防腐剂含量,并对6 家企业共计94 批样品和8 批次鲜竹沥原料药进行防腐剂的筛查和定量测定,以期为该制剂的质量控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器

Agilent 1260 lnfinity Ⅱ高效液相色谱仪，DAD检测器，OpenLAB CDS 化学工作站（美国安捷伦公司）；Secura125-1CN 电子天平（德国赛托利斯公司）。

1.2 试药

苯甲酸（批号：100419-201302，含量：100%），山梨酸（批号：190126-201501，含量：99.6%），羟苯甲酯（批号：100278-201404，含量：100%），羟苯乙酯（批号：100847-201203，含量：100%），羟苯丙酯（批号：100444-201403，含量：99.6%），羟苯丁酯（批号：110792-200503，含量：100%）购自中国食品药品检定研究院。脱氢乙酸（批号：BCBF0386V，含量：98.0%）购自ALDRICH。羟苯异丙酯（批号25192，含量：99.4%），羟苯异丁酯（批号41110，含量：99.7%）购自AccuStandard。复方鲜竹沥液共94 批，来源于国家药品抽检计划抽样；鲜竹沥原料药8 批，由生产企业提供。乙酸铵为分析纯，甲醇为色谱纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件及系统适用性试验［6-10］

色谱柱：资生堂CAPCELL PAK C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）-0.02 mol/L乙酸铵溶液（B），梯度洗脱（0～23 min，5%A；23～65 min，55%A）；流速：1.0 mL/min；检测波长：230 nm（苯甲酸、脱氢乙酸），256 nm（山梨酸、羟苯酯类）；柱温：30 ℃；进样量：20 μL。在上述色谱条件下，9 种防腐剂的理论板数均大于3 000，分离度均大于1.5，拖尾因子在0.95～1.05。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备分别取苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸、羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯、羟苯丁酯、羟苯异丙酯和羟苯异丁酯对照品适量，精密称定，加水制成每1 mL 各含16 μg 的混合对照品溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备精密吸取样品1 mL，置100 mL 量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 方法学验证

2.3.1 专属性试验按处方取各味药材，按制法制备不含防腐剂的阴性样品，再按“2.2.2”项下方法制得阴性样品溶液。取对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液分别按“2.1”项下色谱条件进样分析，结果显示阴性无干扰，图谱见图1。

图1 HPLC色谱图

2.3.2 线性关系考察取各对照品适量，精密称定，加水分别制成6 个质量浓度的系列溶液，分别精密吸取20 μL，注入液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件分析。以各防腐剂成分浓度（μg/mL）为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），拟合标准曲线并进行回归分析。结果显示，各防腐剂成分在各自浓度范围内线性关系良好。结果详见表1。

表1 防腐剂线性关系

2.3.3 重复性试验取样品（批号B190708），平行精密量取6 份，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分析，测得苯甲酸平均含量为0.29%，RSD 为0.6%，其余8 种防腐剂均未检出，表明该方法重复性良好。

2.3.4 回收率试验精密量取已知防腐剂含量的样品6 份,加入混合对照品储备液适量,按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，结果表明该方法准确可靠，结果见表2。

表2 防腐剂回收率结果 %

2.3.5 检出限取对照品溶液，逐级稀释至各对照品色谱峰信噪比（S/N）为3∶1，作为该防腐剂成分的检出浓度（μg/mL），分别计算检出限，结果苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸、羟苯甲酯的检出限为0.001%，羟苯乙酯、羟苯丙酯、羟苯丁酯、羟苯异丙酯、羟苯异丁酯的检出限为0.002%。

2.3.6 稳定性试验取同一混合对照品溶液，室温下放置0 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h，按“2.1”项下色谱条件进样分析，结果各防腐剂峰面积在48 h 内无明显变化，表明被测溶液48 h 内稳定性较好。

2.3.7 耐用性试验实验选择了三种不同品牌的色谱柱，分别为资生堂CAPCELL PAK C18（4.6mm×250mm，5 μm），Waters Sunfire C18 柱（4.6mm×250mm，5 μm）和依利特Supersil ODS2（4.6mm×250mm，5 μm），并取同一混合对照品溶液按“2.1”项下色谱条件进行分析测定。结果9 种防腐剂成分均分离良好且峰面积无明显变化，表明该方法的耐用性较好。

2.4 样品测定

取94 批次复方鲜竹沥液样品和8 批次鲜竹沥原料药，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液。按“2.1”项下色谱条件进行测定，结果94 批次复方鲜竹沥液和8 批次鲜竹沥原料药均检出苯甲酸。94 批次复方鲜竹沥液苯甲酸含量为0.13%～0.30%，8 批次鲜竹沥原料药苯甲酸含量为0.07%～0.22%，均未检出其余8 种防腐剂。

3 讨论

3.1 色谱条件筛选

本实验采用DAD 检测器进行扫描，发现苯甲酸、脱氢乙酸在230 nm 处有最大吸收，山梨酸、羟苯酯类防腐剂在256 nm 有最大吸收。为满足9个化合物检测灵敏度的要求，确定苯甲酸、脱氢乙酸的检测波长为230 nm，山梨酸、羟苯酯类的检测波长为256 nm。实验选择甲醇-0.02 mol/L 乙酸铵溶液作为流动相，考察了不同流动相比例的分离情况，最终确定按“2.1”项下色谱条件进行梯度洗脱。

3.2 测定结果分析

本品种质量标准收载于《中国药典》2020 年版一部，质量标准制法项规定每1 000 mL 使用苯甲酸钠3 g，且依据《中国药典》2020 年版四部通则0181 合剂项下有关规定，山梨酸和苯甲酸的用量不得超过0.3%（其钾盐、钠盐的用量分别按酸计），羟苯酯类的用量不得超过0.05%［11］。对本次抽检的6 家生产企业共94 批次样品和8 批次鲜竹沥原料药进行防腐剂测定，结果显示，各企业添加的防腐剂均符合《中国药典》2020 年版一部、四部有关规定，表明本品种防腐剂的使用情况良好。

3.3 防腐剂抑菌效能及毒性探讨

目前，中药液体制剂生产实际中常用防腐剂为苯甲酸的钠盐和山梨酸的钾盐，其次为苯甲酸、山梨酸、尼泊金酯类防腐剂（羟苯酯类）。有文献报道苯甲酸钠防腐能力小于苯甲酸，苯甲酸防止发酵效果好，但苯甲酸毒性较大，因此苯甲酸的使用受到了争议，许多国家也已禁止使用［8］；山梨酸防腐能力强；尼泊金酯类防腐剂（羟苯酯类）防霉作用强、用量小，是大众认可的毒性较低的防腐剂。另外，防腐剂的联合应用可增强防腐和抑菌效能，是解决防腐剂使用过量的途径之一，应推广应用［12-14］。