基于生信分析筛选乙型肝炎相关肝细胞癌关键基因及其中药防治预测与系统评价

吴辉渊

江西中医药大学附属医院，江西 南昌 330006

我国年新发肝癌38.9 万例，约为全部新发癌症的9.6%［1］。肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)约占原发性肝癌90%，我国的HCC 主要由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）慢性感染引起（约占80%）［2］。中药治疗乙型肝炎相关肝细胞癌具有独特的疗效和优势［3-13］，本研究通过生物信息学研究方法，筛选出乙型肝炎相关肝细胞癌的关键基因并预测相关治疗中药，运用系统评价方法进一步验证其疗效。

1 资料和方法

1.1 获取基因芯片数据

从GEO 数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下载基因芯片数据集（GSE121248，GSE47197），其中GSE121248 芯片数据采用GPL570 平台，包括HBV 相关HCC 患者的70 个肿瘤组织，37 个临近非肿瘤组织；GSE47197 芯片数据采用GPL16699平台，包含HBV 相关HCC 患者的61 个肿瘤组织，63 个临近非肿瘤组织。类型设置为expression profiling by array，种属为“homosapiens”。

1.2 数据的处理与筛选

应用GEO2R（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/）在线工具及EXCEL 软件，以adj.P＜0.05、|logFC|＞1为标准筛选2 个芯片HCC 患者肿瘤组织与邻近非肿瘤组织的差异基因（DEGs），应用 Venny2.1（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）得到交集DEGs，并绘制韦恩图。

1.3 差异基因的功能注释

通过Metascape（https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1）在线工具对1.2 获得的交集DEGs 进行基因本体（GO）功能、京都基因和基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，背景基因设置为“homosapiens”，筛选条件设为P＜0.05。

1.4 蛋白互作网络分析与关键基因的筛选

将1.2 获得的交集DEGs 导入到STRING（https://cn.string-db.org/）进行蛋白-蛋白相互作用（PPI）分析，设置物种为“homosapiens”，highest confidence ≥0.4。将数据导入Cytoscape 3.8.2 软件进行可视化，用CytoHubba 插件对网络进行关联度分析，并根据degree 进行排序，排名前10 的DEGs 作为关键基因。

1.5 关键基因的分析

利 用UCSC Xena（https://xena.ucsc.edu/）分 析关键基因在原发性肝癌和正常组织的表达差异；根据每个关键基因的表达水平的高低，采用Kaplan-Meier Plotter（http://www.kmplot.com/analysis/）数 据库作生存曲线，采用Logrank 检验。

1.6 关键基因的中药预测

将乙型肝炎相关肝细胞癌患者关键基因输入Coremine Medical (https://coremine.com/)检索框，以P＜0.05 且被《中国药典》2020 年版收录为标准进行潜在治疗中药的筛选。最后预测得出与HBV 相关HCC 关系较为密切的中药。

1.7 预测中药的评价与验证

对预测中药的有效性采用Meta 分析进行验证，以“肝癌”“中药”“疗效”等为检索词，检索中国知网（CNKI）、维普（VIP）、万方等中文数据库，从各数据库建库到2022 年4 月20 日。纳入标准：（1）研究对象：病理或临床确诊的HCC 患者；（2）干预方式：对照组采用单纯TACE，观察组采用中药+TACE，中药处方包含3 种及以上预测中药。收集每项研究中第一作者姓名、发表时间、研究患者平均年龄、各组病例数等数据。观察两组治疗后的实体瘤客观缓解率（完全缓解+部分缓解）。采用STATA 17 软件做Meta 分析。对结果进行异质性检验，若P＞0.10 且I2≤50%则认为异质性小，采用固定效应模型进行分析。如纳入研究的文献数≥10，采用“漏斗图”检查文献是否存在发表偏倚。

2 结果

2.1 差异基因数据的获取

GSE121248 芯片中共包含1 320 个DEGs，其中下调基因897 个，上调基因423 个；GSE47197 芯片含有DEGs1 178 个，其中下调基因953 个,上调基因255 个。绘制了2 个芯片DEGs 的火山图（图1、图2）。应用Venny 软件作图（图3）,得出2 个芯片的交集DEGs 403 个，包括上调基因82 个；下调基因321 个。

图1 GSE121248 DEGs 火山图

图2 GSE47197 DEGs火山图

图3 交集DEGs Venn图

2.2 差异基因的功能注释

通过Metascape 在线数据库对403 个交集DEGs 进行功能注释。GO 富集分析包括三方面：分子功能（MF），生物过程（BP），细胞组分（CC），其中MF 主要与氧化还原酶活性、CH-OH 供体组等功能有关；BP 主要与一元羧酸代谢、小分子分解代谢、烯属化合物代谢过程等功能有关；CC 主要与细胞外基质、血液微粒、膜攻击复合物有关。KEGG 分析表明：视黄醇代谢、补体和凝血级联反应、色氨酸代谢、PPAR 信号通路、p53 信号通路等为主要通路。

2.3 蛋白互作网络分析与关键基因的筛选

将2.1 得 到 的403 个 交 集DEGs 导 入String在线数据库，得到蛋白互作网络，再将其数据传入Cytoscape 3.8.1 软件进行可视化展示。利用CytoHubba 插件根据degree 进行排名，选取排名前10 的基因作为关键基因，具体包括CDK1，CCNB1，AURKA，CCNB2，CDKN3，BIRC5，ESR1，NDC80，TPX2，ASPM。见图4。

图4 DEGs的PPI网络图

2.4 关键基因在肝癌组织与正常组织的表达差异

利用UCSC Xena 分析核心基因在原发性肝癌和正常组织的表达差异，除ESR1 在肝癌组织表达下降之外，其他9 个关键基因均在肝癌组织表达上调，经检验结果均为P＜0.001，提示差异有统计学意义。

2.5 关键基因生存分析

利用Kaplan-Meier Plotter 数据库分析上述10个关键基因生存曲线，经Logrank 检验，P＜0.01，均差异有统计学意义。

2.6 作用于关键基因的中药预测

将2.3 筛选得出的 10 个关键基因输入到Coremine Medical，共得出与HBV 相关HCC 有潜在治疗作用的43 种中药，具体见表1。

表1 中药预测

2.7 系统评价

按纳入标准，共检索到文献11 篇，见表2，经异质性检验（P=0.99，I2=0.00%），采用固定效应模型，结果显示［OR=0.55，95%CI：（0.28，0.81）］，合并效应检验Z=4.00，P＜0.001，说明观察组显著优于对照组，见图5。运用STATA17 软件进行偏倚性检测，结果11 个纳入的研究分布在中心线两侧，大多位于漏斗图偏上，均在95%置信区间内，散点分布基本对称，发表偏倚不明显，见图6。

表2 纳入研究的基本特征

图5 临床总有效率Meta分析图

图6 偏倚分析图

3 讨论

细胞周期蛋白依赖性激酶1（CDK1）在细胞有丝分裂过程中发挥作用，是促进肝细胞癌发生的主要的基因之一，CDK1 表达上调促进肝细胞癌增殖失控，与肝细胞癌的组织病理学分级和进展密切相关。cyclin B1 是细胞周期蛋白B1（CCNB1）表达的蛋白，其与CDK1 结合后，在细胞G2/M 期发挥作用，驱动细胞周期时相转换，是促使细胞有丝分裂的关键因子。研究发现：与癌旁组织相较，肝癌组织中CCNB1 蛋白表达水平明显上调，抑制CCNB1蛋白表达后肝癌细胞增殖能力明显降低［14］，细胞周期蛋白B2（CCNB2）属于B 类细胞周期蛋白家族，CCNB1 和CCNB2 共同完成促发细胞进入G2/M期中的重要功能。CCNB2 可能通过增加JAG1 的表达而加速HCC 细胞的增殖和转移［15］。HCC 的多种细胞系激光激酶A（AURKA）表达升高，且与HCC 分级和分期密切相关。敲除Aurora-A 可抑制HepG2 细胞增殖,促进其凋亡［16］。周期素依赖性激酶抑制因子3（CDKN3）基因在肝癌中表达上调，引起细胞周期失去正常调控，导致肝癌的发生，并且在肝癌发展过程中可能发挥重要作用［17］。杆状病毒凋亡抑制蛋白5（BIRC5）属于凋亡抑制蛋白家族，结构简单，是目前抗凋亡作用最强的蛋白分子。BIRC5 在肝癌细胞中呈高表达，其表达水平与肿瘤预后有相关性［18］，核分裂周期蛋白80 (NDC80)在肝细胞癌组织中表达明显高于相应的临近组织［19］。爪蟾驱动样蛋白2 靶向蛋白（TPX2）在细胞有丝分裂过程中起了重要作用，TPX2 基因严格调控极光激酶A（Aurora-A）的活性，精确控制细胞有丝分裂进程，在肝细胞癌的增殖凋亡过程中有重要作用［20］。异常纺锤体样小头畸形相关蛋白（ASPM）基因在肝癌样本中表达上调，且与肿瘤侵袭性显著相关。ASPM 通过拮抗自噬介导的Dvl2 降解激活Wnt/β-catenin 信号传导，促进肝细胞癌进展［21］。雌激素受体（ESR）是一类配体活化的转录调节因子，ESR1 基因组学的变异可能促进HBV 相关HCC 的发生。ESR1 表达增加对总体生存有保护作用，当女性缺乏编码雌激素受体-α 的ESR1 时,二乙基亚硝胺诱导肝癌发生的程度明显更大［22］。

本研究针对乙型肝炎相关肝细胞癌的预测中药主要可以分为以下几类：清热解毒（冬凌草、半枝莲、蟾酥、白花蛇舌草、苦参、山慈菇等），理气和中（九香虫、蚕沙、香橼等），温阳散寒（吴茱萸、干姜、高良姜、补骨脂、菟丝子等），杀虫药（雷丸、使君子等）。绍峰等［23］将原发性肝癌分为几个基本证候：肝胆湿热、（肝）气滞血瘀、（肾）阳虚水停、（胃肠）阴虚证。由此可见，临床诊疗肝癌当以清热解毒，温阳散寒，理气和中等为主。现代药理和临床研究发现清热解毒主要有抑制肿瘤的增值和侵袭，增强放化疗疗效，减轻患者症状的作用［24］。中医认为阳虚气化不足，内生寒邪，“痰、湿、浊、毒、瘀”互结，形成肿块。因此阳虚寒凝为肝癌的核心病机，当以扶阳为基本治法。温阳散寒为主的中药如吴茱萸、干姜、仙茅、补骨脂、淫羊藿等，实验证实可以直接抑制或破坏肝癌细胞，抑制血管形成，诱导肿瘤细胞凋亡［25］。临床运用中药治疗肝细胞癌时，于寒凉之中加入少量辛温之品，如淫羊藿、桂枝、干姜等，即可佐制清热解毒药的寒凉，又可助阳化气，温化癌毒，更好发挥中药抗癌功效。在肝癌治疗过程中当注重健脾理气，肝脾同治。肝癌病位在肝，涉及脾肺肾，尤其要重视脾胃，在肝癌发生发展的各个阶段，都可出现脾虚气滞，在治疗肝癌的中药处方中，加用九香虫、蚕沙、香橼等理气和中药物，有助于调和肝脾，从而减轻患者症状，提高临床疗效。

本研究预测得到中药有43 种，大多是临床常用的药品，其中少部分中药如野马追、木鳖子、土木香、狼毒、救必应、使君子、雷丸等临床极少运用。分析原因可能与医家用药习惯，非药房常备药等有关，同时这些中药均有一定的毒性。本研究探讨了其治疗肝癌的可能机制，下一步将通过现代药理学和临床研究，明确其疗效与安全性。

本研究发现乙型肝炎相关肝细胞癌发生关键基因 有CDK1，CCNB1，AURKA，CCNB2，CDKN3，BIRC5，ESR1，NDC80，TPX2，ASPM。除ESR1 在肝癌组织表达下降之外，其他9 个关键基因均在肝癌组织表达上调，预测得到43 味中药，经系统评价分析证实了其有效性。