九味温灸艾的质量标准研究

杨宝莲，吴建华，廖洲青

赣州市中医院，江西 赣州 341000

九味温灸艾配方源自元代王好古的《此事难知·易老解利法》的九味羌活汤的化裁方，在热敏灸理论基础上，结合赣州市中医院（以下简称我院）针康科多年的临床实践经验，对该方进行了数次修改优化，并最终固定为我院协定处方，此后逐渐发展为我院特色中药制剂。

此方是由艾绒、羌活、沉香、独活、白芷、细辛、川芎、夏天无等9 味中药材组成的复方制剂，具有温经散寒、活血通络的功效，临床上用于风寒湿痹、肌肉酸麻、四肢关节疼痛、脘腹冷痛等症［1-8］。

但因该协定处方由针康科医师临用前自行搓制，个体操作差异大，难以对其质量进行有效的控制，且在使用、保管上均极为不便，为此，我们修改了该制剂的生产工艺。鉴于目前该标准缺少定性、定量等实质性控制指标，本研究参考了《中国药典》2020 年版一部［9］及相关文献，对九味温灸艾质量标准进行了研究，采用显微鉴别法对九味温灸艾中君药艾绒进行定性鉴别，使用薄层色谱鉴别川芎和羌活，采用HPLC 法测定九味温灸艾中指标性成分绿原酸的含量并制订了含量限度。参照《中国药典》2020 年版一部要求，对九味温灸艾的重量差异和水分等项目进行检查，确保有效控制该产品质量。

1 仪器与试药

1.1 仪器

安捷伦1260 型HPLC 仪（紫外检测器），超声波清洗器（深圳冠博科技实业有限公司），万分之一电子天平（mettler-toledo 公司），Saikedigital 显微镜，卡玛薄层色谱数码成像系统。

1.2 药品与试剂

对照品：绿原酸（批号：110753-201817，含量96.8%），羌活醇（批号：111820-201705，含量99.9%），异欧前胡素（批号：110827-201812，含量99.6%）。对照药材：羌活（批号：120935-201809），川芎（批号：120918-201813）。以上对照品/药材均采购自中国食品药品检定研究院。九味温灸艾（赣州市中医院制剂室，批号20200301、20200302、20200303，规格：每支重28 g）。硅胶G 板（青岛海洋，0.20～0.25 mm）。乙腈（色谱纯）、水（超纯水），其余试剂（分析纯）。

2 方法与结果

2.1 鉴别

2.1.1 艾绒的显微鉴别 取样品粉末，用水合氯醛装片，置显微镜下观测：可见T 形毛，顶端长而弯曲，柄2～4 细胞。见图1。

图1 艾绒显微鉴别图（×400）：A.批号20 200301；B.批号20 200302；C.批号20200303。

2.1.2 川芎的TLC 鉴别 取3 批样品各约10 g，分别加入乙醚100 mL，加热回流1 h，滤过，滤液挥干，残渣加乙酸乙酯2 mL 使溶解，即得供试品溶液；另取川芎对照药材0.5 g 及缺川芎阴性样品适量，同法制成对照药材溶液及缺川芎阴性溶液。

吸取上述5 种溶液各10 μL，照TLC 法操作，分别点于同一硅胶G 板上，以正己烷-乙酸乙酯（3∶1）为展开剂，展开，取出后晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点，斑点清晰，分离良好，阴性样品无干扰。经方法学验证，重现性良好，见图2。

图2 九味温灸艾中川芎TLC图

2.1.3 羌活的TLC 鉴别 取3 批样品各约10 g，分别加入乙醚100 mL，超声提取30 min，滤过，滤液挥干，残渣加三氯甲烷1.5 mL 使溶解，得供试品溶液；另取羌活对照药材0.5 g 及缺羌活阴性样品适量，同法制成对照药材溶液及缺羌活阴性溶液；再取羌活醇对照品、异欧前胡素对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成每l mL 各含羌活醇、异欧前胡素1 mg 的对照品溶液。

吸取上述7 种溶液各2 μL，照TLC 法操作，分别点于同一硅胶G 板上，以环己烷-乙酸乙酯（3∶2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷上1%香草醛硫酸溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点，斑点清晰，分离良好，阴性样品无干扰。经方法学验证，重现性良好，见图3。

图3 九味温灸艾中羌活TLC图

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件 Agilent C18 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相采用乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），按表1 进行梯度洗脱，流速1 mL/min；检测波长327 nm；柱温30 ℃；进样量20 μL。

表1 色谱梯度洗脱

2.2.2 溶液的制备 （1）对照品溶液的制备：精密称取绿原酸对照品10.24 mg，置棕色量瓶中，加50%甲醇制成浓度为19.824 6 μg/mL 的溶液，摇匀，即得。（2）供试品溶液制备：取样品约0.7 g，精密称定，置具塞锥形瓶，精密加入50%甲醇25 mL，密塞，称定重量，超声提取（功率350 W，频率40 kHz）30 min 后，取出放冷，再用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤后取续滤液，即得。（3）缺艾绒阴性溶液的制备：取缺艾绒阴性样品同供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。

2.2.3 方法学考察

（1）系统适应性试验。取对照品溶液、供试品溶液和缺艾绒阴性溶液，按“2.2.1”项下色谱条件检测，记录色谱图。绿原酸的保留时间约在13.7 min，能与其他各峰基线达到较好分离，且缺艾绒阴性溶液无干扰。见图4。

图4 HPLC色谱图：A.绿原酸对照品溶液；B.供试品溶液；C.缺艾绒阴性溶液

（2）线性关系考察。分别量取绿原酸对照品溶液（浓度为39.649 3 µg/mL）1 mL、2.5 mL、4 mL、5 mL、7.5 mL、10 mL 置10 mL 量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过。分别精密吸取上述溶液各20 µL，注入液相色谱仪，按“2.2.1”项下色谱条件进样，以浓度（µg/mL）为横坐标、峰面积为纵坐标做线性回归，其回归方程为：Y=76.078X-1.341 4，r=0.999 9，线性范围为3.964 9～39.649 3 µg/mL。

（3）精密度试验。取对照品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件连续进样6 次并记录色谱图，计算得出绿原酸峰面积RSD为0.97%，显示仪器精密度较好。

（4）重复性试验。取九味温灸艾样品（批号：20200301）6 份，按上述“2.2.2”项下方法平行制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定，得出绿原酸含量RSD 为0.52%，显示此法重复性较好。

（5）稳定性试验。取供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件，分别在0、2、4、8、12、18、24 h测定，绿原酸峰面积RSD 为1.95%，表示供试品溶液在24 h 内较稳定。

（6）加样回收率试验。取九味温灸艾样品（批号：20200301，每1 g 含绿原酸0.764 mg）6 份，每份约0.35 g，精密称定，分别精密加入绿原酸对照品溶液（浓度为0.287 3 mg/mL）1 mL 后挥干，按“2.2.2”项下方法配制加样回收样品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定，结果见表2。绿原酸回收率在98.92%～99.79%区间，平均回收率为99.33%，RSD为0.38%，表示本法准确度高。

表2 加样回收试验结果

2.2.4 样品含量测定 取三批九味温灸艾样品（规格：28 g/支），按上述的方法测绿原酸的含量，结果见表3。

表3 样品含量测定结果

2.2.5 样品含量限度的确定 对我院生产的3 批九味温灸艾试样中绿原酸的含量进行检测，结果平均含量为21.4 mg/支。以平均含量的70%拟定含量限度标准为：本品每支含艾绒以绿原酸（C16H18O9）计，不得少于15.0 mg。三批样品的含量均符合拟定限度。

3 其他检查

参照《中国药典》2020 年版要求对样品重量差异、水分等项目进行检查，结果均符合规定。

4 讨论

本研究对处方中的九味药材均进行了薄层鉴别研究，由于沉香、独活、白芷、细辛、夏天无和制远志等六味药材薄层鉴别不够成熟，有待今后进一步研究，暂未列入拟定标准；艾绒的显微鉴别及羌活、川芎薄层鉴别方法重现性好、阴性无干扰，可作为质量控制指标。本研究利用高效液相色谱法建立了艾绒中绿原酸的含量测定方法,结果显示，方法学各项指标考察均符合中药指导原则的要求，说明该方法可操作性强、专属性好、准确度高、稳定可靠，可为九味温灸艾的质量控制提供参考。